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干旱是一种最普遍的环境胁迫。干旱导致水分分配出现异常,对植物造成原生质脱水,光合作用和遗传物质的合成能力减弱等伤害,而且缺水引起的渗透胁迫会造成植株不可逆的损伤,最终导致植株死亡[1]。当植物处于渗透胁迫环境中,它们会通过积累渗透调节物质来降低胁迫所带来的损伤[2]。大量研究表明,脯氨酸的积累和代谢与植物的耐旱性密切相关[3-4]。作为一种小分子有机渗透调节物质,脯氨酸可以提高植物细胞的保水能力,维持细胞膨压,并保护相关酶活性等[3]。在干旱胁迫停止而开始复水的条件下,积累的脯氨酸又可以作为碳、氮源为植物的恢复提供能量物质[5-6]。赵宏伟等[7]在研究水稻(Oryza sativa L.)耐旱机制时发现,耐旱品种东农425的脯氨酸含量显著高于干旱敏感型品种松粳6号,且复水后恢复能力更强。
脯氨酸的合成途径有2条,分别是谷氨酸途径和鸟氨酸途径。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸氨基转移酶(δ-OAT)分别是这两个途径中的关键酶。研究发现,过表达P5CS的转基因植株在胁迫环境下的脯氨酸含量明显高于对照植株,且抗逆性较对照植株也有所增强[8]。王伟东等[9]将拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)的δ-OAT基因转化到烟草(Nicotiana tabacum L.)和水稻中,转基因烟草和水稻的脯氨酸含量增加,抗逆性也显著加强。此外,这2条途径在不同条件下对脯氨酸积累的贡献大小也有所不同,如在甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中,P5CS和OAT基因在干旱胁迫下共同控制脯氨酸的合成,但P5CS基因占主导地位[10]。
中山杉(Taxodium hybrid ‘Zhongshanshan’)是江苏省中国科学院植物研究所通过落羽杉属(Taxodium)种间杂交选育出来的优良无性系的总称。中山杉保持了亲本的优良性状,并表现出良好的适应性与抗逆性,目前已经广泛应用于城市绿化和沿海防护林建设等方面,获得了较好的生态和社会效益[11-12]。作为中山杉的亲本之一,墨杉(T. mucronatum)原产于墨西哥高原地带,对干旱胁迫具有一定的耐受能力[13]。中山杉遗传了亲本墨杉的耐旱性,在重庆三峡库区造林的过程中,当水库处于低水位时,中山杉长期生长在裸露缺水的黄棕壤中,仍然可以生存,并保持较高的存活率[14]。室内试验表明,中山杉杂种优势明显,耐旱性较强[15-16],其主动积累脯氨酸以抵御胁迫伤害;在复水后,脯氨酸含量迅速下降到正常水平[15]。
本研究利用cDNA末端快速克隆技术(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)从中山杉中克隆2个编码P5CS和δ-OAT的基因,并利用生物信息学预测其结构和功能,最终分别命名为ThP5CS和Thδ-OAT。采用半定量技术(sRT-PCR)和实时荧光定量技术(qRT-PCR)分析了中山杉及其亲本在干旱及复水的条件下,其ThP5CS和Thδ-OAT基因相对表达量的变化,以探索ThP5CS和Thδ-OAT与脯氨酸积累以及植物耐旱性的关系,为落羽杉属植物抗逆基因工程提供候选基因资源,同时为中山杉在干旱和半干旱地区的推广应用提供科学依据。
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试验在江苏省中国科学院植物研究所(118°49′ E,32°30′ N)的苗圃进行。供试品种为中山杉407(Taxodium mucronatum ♀ × T. distichum ♂)(T. hybrid ‘Zhongshanshan 407’)、落羽杉(T. distichum)和墨杉(T. mucronatum)。选取2年生植株移入塑料盆(口径为23 cm,底径为15 cm,高为22 cm)中,每盆种植1株植株。栽培基质为黄土、泥炭土和珍珠岩,体积比为3:1:1,最大田间持水量为28.7%。将移植后的植株放置在自然环境中适应3个月,每周充分灌溉2次。
选取18株长势一致的植株移入温室中,用于干旱试验。试验设计如下:设置对照(CK)和干旱-复水(S)2个处理,每个处理9株植株,随机区组排列。在整个试验期间保持每天18:00为CK组的植株补充足够的水分,使其土壤相对含水量(含水量/最大田间持水量)保持在75%~80%的水平。对于S组的植株,干旱过程为连续模拟自然干旱8 d;复水过程为干旱处理结束后的9 d,每天18:00补充水分,使土壤的相对含水量达到75%~80%的水平。分别在干旱胁迫处理0 d(胁迫前,S0),连续干旱8 d(S组所有植株表现出明显的萎蔫现象,干旱阶段,S1),以及复水9 d(复水阶段,S2)对CK和S组的叶片进行取样。每组3个重复,每个重复包含3株植株的叶片样品,取样后立即投入液氮中速冻,然后保存于-80℃冰箱中备用。
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采用天根DP441多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取叶片RNA。利用DNA酶(天根生化科技有限公司)处理提取的RNA,使其纯化。利用2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,并用紫外分光光度计在260 nm和280 nm下检测RNA的浓度与纯度。以1 μg RNA为模板,利用Clontech公司的SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit和AdvantageR 2 PCR Kit试剂盒进行反转录,合成第1链cDNA,存于-20℃冰箱备用。
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通过对中山杉转录组数据的分析,获得所需基因片段的序列信息。根据获得的序列信息,利用Oligo 6.0软件设计引物扩增基因的3′RACE和5′RACE,其中,3′RACE的PCR反应体系参照3′-Full RACE Core Set Kit试剂盒(TaKaRa)的说明书;5′RACE的反应体系参考Clontech公司的SMARTer RACE 5′/3′Kit试剂盒的说明书。使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并用QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒(QIAGEN)进行回收。将回收产物连接到pMD19-T Vector载体(TaKaRa)上,并转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α感受态细胞,再将筛选到的阳性克隆菌液送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。根据3′RACE和5′RACE的测序结果,利用软件BioXM 2.6进行比对拼接,获得基因全长序列。利用ORFfinder工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测ORF开放阅读框序列,并设计引物,以cDNA为模板进行ORF序列扩增加以验证。引物序列见表 1。
引物名称
Prime-ID正向引物
Forward PCR Primer(5′-3′)反向引物
Reverse PCR Primer(5′-3′)Thδ-OAT_3OUTER TGATTGCTGATGAAATACAAACTGG TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT Thδ-OAT_3INNER GGGCTGTTGAGATGGGACAAGTCTTTAG CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG Thδ-OAT_5OUTER CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT AATGGGTTCAAAGAGAAATCCAGCA Thδ-OAT_5INNER CTAATACGACTCACTATAGGGC AGTATTCATTGGAAGCACCATGTCATAG Thδ-OAT_ORF ATGAACAACATGACAATGGCGAT TGCCTGCAGGTCGACGATTGTA Thδ-OAT_sRT-PCR ATGAACAAGAGTACAGTGCTCA AACAATAATTCCCTCATTTTTT Thδ-OAT_qRT-PCR ACTGGAGCAGAGGGTGTTGAA AGTTGACCAGGGAGGAACGG ThP5CS_3OUTER TGCTCAAGCTGGATGATGTTATAGA TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT ThP5CS_3INNER TGTCAGATTGTATGGTGGCACAAAGGCA CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG ThP5CS_5OUTER CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT CCTTCAACGTCACTCAGGAGAATCAG ThP5CS_5INNER CTAATACGACTCACTATAGGGC CATTATCAGTTACAAGAAGTTGGGATGA ThP5CS_ORF ATGACAGCTAAAGTTAAAGCTGCT GGTTTTCAAATCACAACCATT ThP5CS _sRT-PCR GCTGGTATTCCTGTTGTTATTA ATCTTTCCAGGTTTTAACATTA ThP5CS_qRT-PCR GACCTCCAGAAGCCACAGGT GAACCACGCGCAACTCTAGC 18S _sRT-PCR TAAAAGAAGAAGAAGAAGCAAA TGAAAATGAGAGGTGAAGAGAT GAPDH_qRT-PCR CCATCGGAGCCCATTATCAG ACTATGTTCAACGCCGCTGC Table 1. Sequences of primers
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利用BLASTsoftware(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和拟南芥信息资源网站(TAIR)(http://www.arabidopsis.org/Blast/index.jsp)在线分析基因序列和氨基酸序列;利用ExpasyProtparam工具(http://web.expasy.org/protparam/)在线预测蛋白质的分子量大小、等电点等;利用GOR4软件预测蛋白的二级结构(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html);利用InterPro网站预测基因的结构域,并利用NCBI数据库中的Protein BLAST和MEGA 5.1软件的Clustal W程序进行同源序列比对;使用MEGA 5.1软件并选择最大似然法(Maximum Likelihood method)进行系统发育树的构建[17]。
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利用软件Oligo 6.0设计参照基因18S rRNA和2个目的基因(ThP5CS和Thδ-OAT)sRT-PCR的特异引物(表 1)。sRT-PCR扩增体系为20 μL:1 μL Taq酶,2 μL 10 ×PCR Buffer(Mg2+ Free),1.5 μL Mg2+(25 mmol·-L-1),1.3 μL dNTP mixture(2.5 mmol·-L-1 each),各1 μL 5′端和3′端引物(10 pmol·μL-1),1 μL cDNA(cDNA浓度大约是1 000 ng·μL-1),11.2 μL ddH2O。PCR条件为:94℃、4 min;94℃、30 s,55℃、30 s,72℃、30 s,25个循环;72℃、10 min;4℃终止反应。使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物[18]。利用软件Oligo 6.0设计内参基因GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate)和2个目的基因的qRT-PCR引物(表 1)。利用Analitik Jena qTOWER2.2(德国)系统进行qRT-PCR。按照SYBR Green试剂盒(Rox)说明书操作,扩增程序为:55℃ 2 min,95℃ 10 min;95℃ 15 s,60℃ 1min,进行40个循环。随后设置60℃至95℃,生成融解曲线。每个样品进行3个技术性重复,20 μL的反应体系中包含:2 μL稀释后的cDNA(稀释比例为1:3,稀释后的cDNA浓度大约是350 ng·μL-1),10 μL FastStart Universal SYBR Green Master(Rox),6 pmol上游引物,6 pmol下游引物以及6.8 μL ddH2O。基因的相对表达量按照2-ΔΔCt方法进行计算[19];试验数据经SPSS 19.0软件统计分析并绘图;数据采用Duncan法(P<0.05)进行单因素方差分析。
1.1. 试验材料和设计
1.2. RNA的提取及cDNA的合成
1.3. ThP5CS和Thδ-OAT基因全长的克隆
1.4. ThP5CS和Thδ-OAT基因的序列分析
1.5. ThP5CS和Thδ-OAT基因的表达分析
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利用3′RACE扩增技术获得2个编码中山杉δ-OAT和P5CS基因长度分别为229 bp和242 bp的3′端序列,利用5′RACE扩增技术获得编码中山杉δ-OAT和P5CS基因长度分别为95 bp和763 bp的5′端序列(表 2)。经过序列比对分析,得到编码中山杉δ-OAT和P5CS基因的全长,长度分别是1 818 bp和2 550 bp(表 2)。编码中山杉δ-OAT的基因包含1个长度为1 494 bp的ORF开放阅读框,共编码497个氨基酸;编码中山杉P5CS的基因包含1个长度为1 545 bp的ORF开放阅读框,共编码514个氨基酸(表 2)。
Gene_ID Full-length cDNA/bp 5′UTR /bp 3′UTR/bp ORF/bp 预测多肽Predicted peptide 二级结构预测Secondary structure prediction MW/kDa PI GRAVY Hh/% Ee/% Tt/% Cc/% Thδ-OAT 1 818 95 229 1 494 55.11 6.26 -0.174 44.06 11.47 0.00 44.47 ThP5CS 2 550 763 242 1 545 55.32 6.35 0.036 36.19 18.09 0.00 45.72 Table 2. Features of the Thδ-OAT and ThP5CS
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利用TAIR网站,将编码中山杉δ-OAT和P5CS基因序列分别与拟南芥AT5G46180.1;AT3G55610.1基因序列进行比对,其序列相似性分别为82%和86%;将2个基因的蛋白质氨基酸序列在GenBank中进行Blast搜索,发现编码OAT的基因与樟子松(Pinus sylvestris L. CAJ76070.1)的蛋白序列相似性为92%;编码P5CS的基因与花烛属植物(Anthurium amnicola JAT40271.1)的蛋白序列相似性为87%,将2个基因命名为Thδ-OAT和ThP5CS。
利用ExpasyProtparam工具对Thδ-OAT和ThP5CS序列进行在线分析,推测Thδ-OAT蛋白质的分子量为55.11 KD,理论等电点为6.26,平均亲水系数为-0.174,为亲水性蛋白;ThP5CS蛋白质的预测分子量为55.32 KD,理论等电点为6.35,平均亲水系数为0.036,为疏水性蛋白。利用GOR4软件预测蛋白二级结构,结果显示:Thδ-OAT蛋白由3种结构模块组成,分别是44.06%的α-螺旋,11.47%的延伸链和44.47%的随机卷曲;而ThP5CS蛋白是由36.19%的α-螺旋,18.09%的延伸链和45.72%的随机卷曲组成的。
使用MEGA 5.1软件并选择最大似然法(Maximum Likelihood method)进行系统发育树的构建,bootstrap自检值设为1 000。选择其他物种:樟子松(Pinus sylvestris L. CAJ76070.1)、梅(Prunus mume Sieb. et Zucc XP_008225506.1)、菠萝(Ananas comosus L. XP_020092479.1)、油棕(Elaeis guineensis Jacq. XP_010940988.1)、桐油树(Jatropha curcas L. AKH80292.1)、烟草植物(Nicotiana attenuata XP_019259981.1)、蓖麻(Ricinus communis L. XP_002519647.2)、白梨(Pyrus × bretschneideri Rehd. XP_009360915.1)、甜瓜(Cucumis melo L. XP_008444491.1)、平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd. AEO51063.1)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon L. XP_003561949.1)、斑茅(Saccharum arundinaceum L. ABV03818.1)参与Thδ-OAT多重序列比对和系统进化树的构建。选择其他物种:油棕(Elaeis guineensis L. XP_010931200.1)、菠萝(Ananas comosus L. XP_020114091.1)、甜瓜(Cucumis melo L. XP_008441400.1)、海枣(Phoenix dactylifera L. XP_008777668.1)、可可树(Theobroma cacao L. XP_017976980.1)、荷花(Nelumbo nucifera Gertn. XP_010263774.1)、巨桉(Eucalyptus grandis L. XP_010067456.1)、花烛属植物(Anthurium amnicola JAT40271.1)、胡桃(Juglans regia L. XP_018809084.1)、毛果杨(Populus trichocarpa EEF01373.1)、棉花(Gossypium arboreum L. ACI62865.1)、枣(Ziziphus jujuba Mill. XP_015897148.1)参与ThP5CS多重序列比对和系统进化树的构建。多重序列比对结果显示:Thδ-OAT、ThP5CS分别与其他物种基因的同源性都较高(图 1、图 2)。系统进化树构建结果显示:中山杉Thδ-OAT与樟子松亲缘关系较近,中山杉ThP5CS与花烛属植物亲缘关系较近,聚为一个分支(图 3、4)。
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分别以干旱胁迫处理0 d(S0),连续干旱8 d(S1),以及复水9 d(S2)的cDNA为模板,通过半定量与定量PCR技术对Thδ-OAT和ThP5CS基因的表达特性进行分析。与前期获得的脯氨酸含量变化趋势相一致[15],干旱处理后,ThP5CS的表达量在中山杉407及其父母本中均显著上调(P<0.05)(图 5),其中,中山杉407 ThP5CS的表达量是对照的4.38倍;落羽杉和墨杉ThP5CS表达量分别为对照的2.08倍和2.13倍。复水后,ThP5CS的表达量均呈下降的趋势。Thδ-OAT基因在中山杉407及落羽杉中表达量均显著低于对照(P<0.05),复水后表达量变化不明显;而在母本墨杉中,干旱环境使得Thδ-OAT表达量显著上调(P<0.05),达到对照的2.67倍,复水后,基因表达量显著下降(P<0.05)。