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石斛兰(Dendrobium Sw.)隶属兰科(Orchidaceae)树兰亚科(Epidendreae Humb),与卡特兰(Cattleya Lindl.)、蝴蝶兰(Phalaenopsis Bl.)和文心兰(Oncidium Lindl.)并称为世界四大观赏洋兰[1-2]。石斛兰因其花大、花形奇特、花色鲜艳等特点,是重要的新花卉作物资源[1]。
花香是评价观赏植物和切花的重要观赏性状之一,香花育种一直是重要的育种目标[3]。长期以来,石斛兰杂交育种忽略了对花香性状的选择,导致众多商品石斛兰不具有香气,培育芳香型品种成为国际石斛兰育种的重要趋势之一[1]。
关于石斛属植物花香的研究报道较少,张莹等[4]分析了4种商品石斛兰鲜花的香气成分,丁灵等[5]测定了7种秋石斛鲜花的挥发性成分,李崇晖等[6]调查了4种石斛原生种鲜花的香气组分,吕素华等[7]分析了11个铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)杂交家系鲜花的挥发性,这些研究认为, 萜烯类、酯类、醇类和醛类对石斛的花香起着重要的作用。目前,未见石斛兰鲜花挥发性成分和含量的日动态变化分析,也未见不同开花阶段挥发性成分变化的研究报道。鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum Lindl.)开花性好,香气迷人,是著名的春石斛观赏种,也是灯笼石斛组的重要育种亲本之一[1-2]。
固相微萃取技术(SPME)已广泛应用于花卉[4-7]、果蔬[8-9]、食品[10]等的挥发性成分检测,具有操作简便、灵敏度高等优点。65 μm PDMS/DVB萃取头对较高沸点的极性挥发性物质灵敏度更大一些,较多的应用于花朵香气成分分析[4-5, 11-13]。本研究运用固相微萃取结合GC/MS联用技术定性、定量分析鼓槌石斛开花过程中香气成分变化以及盛花期香气日动态变化,明确鼓槌石斛花的特征香气来源,为探讨石斛兰香气形成机制和香花型石斛兰育种提供参考。
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经GC/MS分析,鼓槌石斛花蕾期、初开期、盛开期和衰败期的花朵中共鉴定出挥发性成分33种(图 2,表 1)。在开花过程中,总香气成分的释放量变化差异很大,花蕾期的香气成分最少,仅为每花5.2 nmol,初开期略有上升,为每花13.48 nmol,随着花朵开放总香气成分迅速上升到盛开期时的每花167.48 nmol,之后随着花朵的衰败下降到每花10.36 nmol。
化合物
Compound保留时间
Retain time/min释放量/(nmol·flower-1) 蕾期Flower bud 半开期Half opening stage 盛开期Full opening stage 衰败期Wilting stage 酯类Ester 异戊酸辛酯octyl3-methylbutanoate 3.549 - 0.14±0.02 - - 2-甲基丁烯酸甲酯Methyl Angelate 5.472 - 5.56±1.14 - - 4-苯甲基戊酯4-Ethylbenzoic acid,cyclopentyl easter 6.781 - - 10.62±2.10 - 乙酸辛酯Octyl acetate 7.077 - 0.26±0.09 76.71±2.91 - 2-苯乙醇乙酸酯2-Acetic acid,2-phenylethyl ester 17.047 - - 0.61±0.06 - 癸酸甲酯Methyl caprate 20.719 - - 1.39±0.04 - 乙酸月桂酯Lauryl acetate 23.479 - - 0.45±0.02 - 合计Total 5.96 89.78 醛类Aldehyde 苯乙醛Benzeneacetaldehydo 11.001 - - 14.73±1.47 - 合计Total - - 14.73 - 醇类Alcohol 辛醇1-Octanol 11.994 - - 5.43±0.77 - 芳樟醇Linalyl acetate 12.972 - - 0.50±0.04 - 苯乙醇Phenylethyl alcohol 13.480 - - 0.59±0.06 - 马鞭草烯醇Verbenone 15.366 - - 0.52±0.04 - 松油烯-4-醇Terpinen-4-ol 15.701 - - 1.03±0.14 0.69±0.10 木焦油醇Creosol 16.268 - - 0.60±0.06 - 合计Total 8.67 0.69 酮类Ketone 1-薄荷酮1-Menthone 20.011 - - 0.63±0.04 - 环己酮Cyclohexanone 20.015 - - 1.57±0.03 - 合计Total 2.2 芳香族化合物Aromatic O-甲基异丙基苯O-Cymene 10.298 - - 0.44±0.02 - 叔丁基对苯二酚t-Butylhydroquinone 17.991 - - 1.01±0.04 - 合计Total 1.45 萜烯类Terpene α-水芹烯α-Phellandrene 7.135 - - 1.20±0.12 - α-蒎烯α-Pinene 7.339 1.22±0.15 1.87±0.21 11.37±1.10 0.66±0.27 崖柏烯Thujene 7.963 - - 0.61±0.15 - β-蒎烯β-Pinene 8.679 - - 1.46±0.06 - L-β-蒎烯L-β-Myrcene 9.183 - - 1.39±0.28 - 1, 3, 8-对-薄荷三烯1, 3, 8-P-Menthatriene 9.623 - - 0.42±0.02 - α-松油烯α-Terpinene 10.024 - - 0.61±0.11 0.57±0.07 对伞花烃O-Cymene 10.288 0.48±0.06 D-柠檬烯D-Limoene 10.439 - 0.59±0.08 3.72±0.30 - 桉油精Eucalyptol 10.531 2.80±0.69 - 1.02±0.74 - 顺-β-罗勒烯Trans-β-Ocimene 10.785 - - 0.75±0.29 - β-罗勒烯β-Ocimene 11.182 1.18±0.16 5.06±2.32 25.40±2.40 7.98±2.16 γ-松油烯γ-Terpinene 11.501 - - 0.88±0.26 0.46±0.03 2-蒈烯2-Carene 12.540 - - 0.48±0.03 - 3-蒈烯3-Carene 14.420 - - 0.86±0.13 - 合计Total 5.2 7.52 50.65 9.67 注:“-”:未检测到或不存在。Note:“-”:Not detected or not existed. Table 1. Aromatic component categories and their contents at different blooming stages of Den. chrysotoxum flower
整个花期释放的香气成分可划分为6类,包括酯类、醛类、醇类、酮类、芳香族化合物和萜烯类。蕾期的香气成分极少,只有3种,主要是萜烯类。初花期增加到6种,为酯类和萜烯类,分别占总香气含量的44.2%和55.8%,进入盛花期后,酯类、醛类、醇类、酮类、芳香族化合物和萜烯类都有检测到,组分也增加到31种,以酯类和萜烯类为主,占总香气成分的53.6%和30.2%。衰败期,香气组分迅速下降为5种,以萜烯类为主(93.3%),还检测到极少量的醇类。鼓槌石斛不同开放期花香成分的酯类、醛类、醇类、酮类、芳香族化合物和萜烯类释放量皆呈先上升后下降的趋势,在盛花期的含量达到最高。
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图 3为鼓槌石斛盛花期1 d中5个时期花香释放的总离子流图,扣除本底杂质后,从鼓槌石斛盛开期花朵释放的花香中共鉴定出挥发性成分31种(表 2),其中,萜烯类15种,酯类5种,醇类6种,以及少量的醛类、酮类和芳香族化合物。鼓槌石斛一天中不同时间段花香的总释放量存在明显差异,8:00时测定的总释放量为每花99.08 nmol,随后总释放量逐渐上升,11:00时,增加到每花122.86 nmol,14:00时达到最高(每花167.48 nmol),之后总释放量迅速下降,17:00时,减少为每花56.3 nmol,20:00时总释放量最少,仅为每花25.07 nmol。鼓槌石斛盛花期花香总释放量在日变化中呈先上升后下降的趋势,在14:00时达到最大值。
Figure 3. The TIC of VOCs emitted from full blossoming stage of Den. chrysotoxum at different sampling time
化合物
Compound保留时间
Retain time/min释放量/(nmol·flower-1) 8:00 11:00 14:00 17:00 20:00 酯类Ester 4-苯甲基戊酯4-Ethylbenzoic acid,cyclopentyl easter 6.781 5.48±1.39 4.43±0.52 10.62±2.10 8.88±0.90 8.71±0.88 乙酸辛酯Octyl acetate 17.047 46.07±4.74 52.75±8.11 76.71±2.91 32.69±3.15 11.37±2.31 2-苯乙醇乙酸酯2-Acetic acid,2-phenylethyl ester 18.461 1.01±0.02 - 0.61±0.06 - - 癸酸甲酯Methyl caprate 20.719 - 0.54±0.02 1.39±0.04 1.97±0.62 - 乙酸月桂酯Lauryl acetate 23.479 - 0.31±0.01 0.45±0.02 - - 合计Total 52.56 58.03 89.78 43.54 20.08 醛类Aldehyde 苯乙醛Benzeneacetaldehydo 11.001 8.56±0.90 9.19±1.11 14.73±1.47 3.32±0.18 - 合计Total 8.56 9.19 14.73 3.32 - 醇类Alcohol 辛醇1-Octanol 11.994 4.46±0.44 4.07±1.05 5.43±0.77 2.81±0.31 1.44±0.08 芳樟醇Linalyl acetate 12.972 - - 0.50±0.04 - - 苯乙醇Phenylethyl alcohol 13.480 - 0.82±0.12 0.59±0.06 - - 马鞭草烯醇Verbenone 15.366 - - 0.52±0.04 - - 松油烯-4-醇Terpinen-4-ol 15.701 - 0.93±0.10 1.03±0.14 - - 木焦油醇Creosol 16.268 - 0.78±0.29 0.60±0.06 - - 合计Total 4.46 6.60 8.67 2.81 1.44 酮类Ketone 1-薄荷酮1-Menthone 20.011 0.41±0.02 0.52±0.04 0.63±0.04 - - 环己酮Cyclohexanone 20.015 1.23±0.82 1.61±0.32 1.57±0.03 - - 合计Total 1.64 2.13 2.20 芳香族化合物Aromatic O-甲基异丙基苯O-Cymene 10.298 - 0.61±0.04 0.44±0.02 - - 叔丁基对苯二酚t-Butylhydroquinone 17.991 - 0.65±0.16 1.01±0.04 - - 合计Total 1.26 1.45 萜烯类Terpene α-水芹烯α-Phellandrene 7.135 1.36±0.16 - 1.20±0.12 - - α-蒎烯α-Pinene 7.339 9.04±0.13 14.81±6.85 11.37±1.10 0.79±0.24 0.36±0.04 崖柏烯Thujene 7.963 - - 0.61±0.15 - - β-蒎烯β-Pinene 8.679 1.36±0.27 2.05±0.86 1.46±0.06 - - L-β-蒎烯L-β-Myrcene 9.183 1.15±0.17 1.23±0.06 1.39±0.28 - - 1, 3, 8-对-薄荷三烯1, 3, 8-P-Menthatriene 9.623 - 0.31±0.04 0.42±0.02 - α-松油烯α-Terpinene 10.024 - - 0.61±0.11 - - 对伞花烃O-Cymene 10.288 - - 0.48±0.06 - - D-柠檬烯D-Limoene 10.439 1.69±0.17 2.69±0.23 3.72±0.30 0.55±0.10 - 桉油精Eucalyptol 10.531 - 0.62±0.17 1.02±0.74 - - 顺-β-罗勒烯trans-β-Ocimene 10.785 - - 0.75±0.29 - - β-罗勒烯β-Ocimene 11.182 16.04±2.55 21.65±1.25 25.40±2.40 4.83±0.88 2.51±0.81 γ-松油烯γ-Terpinene 11.501 1.22±0.12 1.01±0.29 0.88±0.26 0.46±0.03 0.68±0.22 2-蒈烯2-Carene 12.540 - 0.41±0.04 0.48±0.03 - - 3-蒈烯3-Carene 14.420 - 0.87±0.14 0.86±0.13 - - 合计Total 31.86 45.65 50.65 6.63 3.55 注:“-”:未检测到或不存在。Note:“-”:Not detected or not existed. Table 2. Aromatic component categories and their contents from full blossoming stage of Den. chrysotoxum at different sampling time
鼓槌石斛盛开期花朵挥发性成分的种类和释放量在日变化中差异较大,8:00时测定的挥发性成分为14种,以酯类、萜烯类和醛类为主,其释放量分别占总香气成分的53.0%、32.2%和8.6%。随后,在11:00时,挥发性组分的种类开始增多(23种),萜烯类和醇类的种类明显增加,它们的释放量也分别增加到37.2%和5.4%(占总香气成分的)。14:00时,挥发性成分的种类达到最多(31种),香气各组分的释放量在此时也达到最大值,酯类、萜烯类和醛类分别占总香气成分的53.6%、30.2%和5.2%。17:00时,醇类和萜烯类组分明显减少,它们占总香气成分的含量也降为11.8%和5.0%。20:00时测定的挥发性成分最少,只有6种,以酯类为主,释放量占总香气成分的80.1%。香气成分种类和释放量在日变化中皆呈先上升后下降的趋势,其中,香气种类和释放量在14:00时达到最大值。鼓槌石斛盛花期花香中的酯类、萜烯类、醛类、醇类酮类和芳香族化合物释放量呈先升高后降低的趋势。
鼓槌石斛盛花期主要花香成分乙酸辛酯、β-罗勒烯、α-蒎烯和苯乙醛释放量的日变化差异明显。乙酸辛酯是一天中各个时段释放量最高的挥发性组分,其释放量呈先上升后下降的趋势;β-罗勒烯和α-蒎烯这2类萜烯类物质释放量也比较高,其中,β-罗勒烯在14:00时释放量最大,而α-蒎烯在11:00时释放量最大;苯乙醛在20:00时未检测到,其它时间段释放量也是先上升后下降。可以看出,酯类、萜烯类和醛类是鼓槌石斛花香的主要成分,而其它醇类和芳香族化合物也是鼓槌石斛花香气的重要组成部分。