iTRAQ Quantitative Proteome Analysis of Kernel Oil Body in Different Growth Stages of Vernicia fordii

选取浙江杭州市富阳区黄公望森林公园虎山林区的5年生油桐单株，于2016年8月15日、9月10日和9月26日收集油桐果实，分别命名为OB1、OB2和OB3，剥取种仁，液氮速冻，-70℃冰箱保存备用。

参照Vesna等油体提取方法^[16]。取5 g油桐种仁，在15 mL预冷的匀浆液GMⅠ(1 mmol·L^-1 EDTA，10 mmol·L^-1 KC1，1 mmol·L^-1 MgCl₂, 2 mmol·L^-1 DTT，0.6 mmol·L^-1 Sucrose，0.15 mol·L^-1 Tcicine-KOH，pH 7.5)中研磨成匀浆；加入15 mL FMⅠ(0.4 mmol·L^-1 Sucrose，其它成分同GM I)混匀；10 000 g离心30 min，取上层油层；将油层重悬于15 mL GMⅡ(GM I + 2 mol·L^-1 NaC1)，加入15 mL FMⅡ(FM I + 2 mol·L^-1NaC1)混匀；10 000 g，30 min，取上层油层；将油层再重悬于15 mL GMⅠ，加入15 mL FMⅠ；10 000 g，30 min，取上层油层；室温重悬于15 mL GMⅡ，震荡30 min；10 000 g，30 min，取上层油层；将油层悬浮于15 mL GMⅠ(4℃预冷)，加15 mL FMⅠ(4℃预冷)；10 000 g，30 min，取上层油层；最终油层悬浮于3 mL GMⅠ，4℃保存备用。

取0.5 mL油体，加入0.75 mL氯仿/甲醇(2:1，v/v)，振荡；13 000 g，5 min；富含蛋白的中间相重悬于0.25 mL水，加入0.75 mL氯仿/甲醇(2:1，v/v)，振荡；13 000 g，5 min；重复加入0.75 mL氯仿/甲醇(2:1，v/v)，振荡洗涤2次以上；最后中间层重悬于0.5 mL水，超声波处理5 min；加入4倍体积的冷丙酮，于-20℃沉淀16 h以上。取样品于10 000 g, 4℃离心15 min，加入适量PBS充分混匀，转移沉淀至新的离心管；于5 000 g, 4℃离心5 min，弃上清；每管加入适量无SDS L3，终浓度为1 mmol·L^-1的PMSF、2 mmol·L^-1的EDTA，置于冰上5 min后加入终浓度为10 mmol·L^-1的DTT，冰浴超声5 min，25 000 g, 4℃离心15 min，取上清；加终浓度10 mmol·L^-1 DTT，56℃水浴1 h；加终浓度55 mmol·L^-1 IAM，暗室放置45 min；于25 000 g, 4℃离心15 min，上清即为蛋白质溶液。

Bradford定量：在96孔酶标板A1至A10位置依次加入标准蛋白(0.2 μg·μL^-1 BSA)0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 μL，再依次加纯水20、18、16、14、12、10、8、6、4、2 μL，之后各孔加考马斯亮蓝G-250定量工作液180 μL。用SpectraMax iD3酶标仪(美谷分子仪器(上海)公司)测量OD₅₉₅，依据OD₅₉₅与蛋白浓度制作线性标准曲线。稀释待测蛋白质溶液若干倍，在20 μL蛋白溶液中加180 μL定量工作液，读取OD₅₉₅。依据标准曲线以及样品OD₅₉₅计算样品蛋白浓度。

SDS-PAGE：每个样品取10 μg蛋白溶液，加入适量Loading buffer混匀后95℃加热5 min，25 000 g离心5 min，取上清点入12% SDS聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中。120 V恒压电泳2 h；电泳结束后，考马斯亮蓝染色2 h，之后加入适量脱色液(40%乙醇，10%醋酸)置于摇床脱色液35次，每次30 min。

每个样品取100 μg蛋白溶液；按蛋白:酶=40:1的比例加Trypsin酶2.5 μg，37℃酶解4 h；按上述比例再补加Trypsin 1次，37℃继续酶解8 h；酶解的肽段利用Strata X柱进行除盐，真空抽干。

根据样品数量，取出一定量ITRAQ标签试剂；待试剂恢复至室温后，每管试剂加50 μL异丙醇，涡旋震荡后低速离心；用0.5 mol·L^-1 TEAB溶解肽段样品，并加到对应ITRAQ标签试剂中。不同样品肽段选用不同的ITRAQ标签；室温静止2 h。

采用LC-20AB液相色谱仪(日本岛津公司)，分离柱为5 μm 4.6×250 mm Gemini C18柱对样品进行液相分离。用2 mL流动相A(5%CAN，pH9.8)复溶抽干的肽段样品并进样，以1 mL·min^-1的流速梯度洗脱：5%流动相B(95% CAN，pH9.8)10 min，5%至35%流动相B 40 min，35%至95%流动相B 1 min，流动相B持续3 min，5%流动相B平衡10 min。在214 nm波长下监测洗脱峰并每分钟收集组分，结合色谱洗脱峰图合并样品得到20个组分，然后冷冻抽干。

将肽段样品用流动相A(2% ACN，0.1%FA)复溶，20 000 g离心10 min后，取上清进样。通过LC-20AD纳升液相色谱仪(日本岛津公司)进行分离。样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱(75 μm内径，3.6 μm柱料粒径，15 cm柱长)串联，以300 NL·min^-1流速通过如下有效梯度进行分离：08 min，5%流动相B(98%ACN，0.1% FA)；843 min，流动相B从8%线性升至35%；4348 min，流动相B从35%升至60%；4850 min，流动相B从60%升至80%；5055 min，80%流动相B；5565 min，5%流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪。

经过液相分离的肽段进入到ESI串联质谱仪：TripleTOF 5600(SCIEX, Framingham, MA, USA)，离源为Nanospray III source(SCIEX, Framingham, MA, USA)，放射器为石英材料拉制的喷针(New Objectives, Woburn, MA，USA)。数据采集时，质谱仪的参数设置如下：离源喷雾电压2 300 V，氮气压为30 psi，喷雾气为15，喷雾接处温度150℃。采用高灵敏度模式进行扫描，一级质谱扫描累积时间为250 ms，扫描质量范围为3501 500 Da。基于扫描信息，按照一级谱图中的离子强度从高到低，选择强度超过150 cp的前30个进行碎裂并扫描二级信息，筛选标准如下：(1)m/z扫描范围为3501 250 Da；(2)电荷数目为25个电荷；(3)母离动态排除设置为：在一半的出峰时间内(约12 s)，相同母离子的碎裂不超过2次。二级质谱的扫描累积时间为100 ms。针对ITRAQ类型的数据采集，碎裂能量选择根据ITRAQ试剂调整，第4级杆Q2在100 Da时的离传输效率为100%。

原始质谱数据经过ProteoWizard工具msConvert转换成包含二级质谱(MS/MS)谱图信息的mgf格式文件后，用蛋白质鉴定软件Mascot与NCBInr、SwissProt/UniProt、Tremble数据库进行比对搜索得到最终的蛋白鉴定结果^[17]。最终选定的可信蛋白必须包含至少一个可信的特异性(Unique)肽段, 同时进行质控分析以判断本次数据是否合格。

利用IQuant软件进行ITRAQ数据的定量分析^[18]。IQuant的工作流程主要包括一下几个步骤：蛋白质过滤，报告基团标签纯度校正，定量值归一化，缺失值补全，蛋白定量值计算和统计检验分析。首先在谱图/肽段水平进行1% FDR的过滤(PSM-level FDR≤0.01)，从而获得显著性鉴定的谱图和肽段列表。接着基于“简约原则”利用肽段进行蛋白组装并产生一系列蛋白组。为了控制蛋白的假阳性率，在蛋白水平上以FDR 1%再次进行过滤(Protein-level FDR≤0.01)。同时，利用定量重复性分析对本次定量数据的质量进行判断。

对鉴定蛋白进行GO、Pathway、COG等功能注释，差异蛋白进行GO、Pathway富集分析。以P-value < 0.05和FDR < 0.01两个条件对差异蛋白进行筛选，从定量结果中筛选出更为关心的显著差异蛋白。在差异蛋白的GO富集分析中，通过显著差异蛋白和作为背景的全体鉴定蛋白相比，利用超几何检验找出显著富集的GO条目；差异蛋白的Pathway富集分析原理类似于此。

经作者对7—10月份的油桐种仁中桐油和桐酸的变化趋势分析，发现8月中旬到9月下旬是桐油的快速积累时期，且在8月15日、9月10日和9月26日3个时期中，桐油和桐酸的含量具有明显差别，因此, 选取生长于这3个时期的油桐果实进行油体蛋白质组的提取，每个时期进行2次重复实验，共6组样品，分别命名为：OB1a、OB1b、OB2a、OB2b、OB3a、OB3b。根据Bradford定量方法，得到的定量标准曲线为y=2.746 7x + 0.031 6，R² = 0.990 2。根据此标准曲线，提取的油体蛋白质组的浓度分别为0.72、1.19、0.31、0.53、0.61和0.63 μg·μL ^-1。

经过SDS-PAGE分离后，油体蛋白质组样品表现出优良的完整性，电泳检测结果显示:分子量大小在1497 kDa之间的蛋白质均有分布(图 1)。且3个时期的2个重复样品之间具有良好的重复性，说明提取的油体蛋白质组的质量较高，满足iTRAQ定量的实验条件。

Figure 1.  SDS-PAGE of the proteins of kernel oil body in different stages of V. fordii

检测的6组样品共生成382 390张二级谱图。在“1%FDR”的过滤标准下，共有24 909条肽段和5 632个蛋白得到鉴定(表 1), 其中，油体蛋白质的分子量大小为3.42490.53 kDa，蛋白质分子量分布图显示分子质量大小在1060 kDa之间的蛋白质较多，占所有检测蛋白的59%(图 2a)。肽段长度分布图显示:鉴定到的肽段长度主要集中在717 aa之间(图 2b)。特异性肽段数目分布图显示:在鉴定到的5 632个蛋白中，特异性肽段数目大于1的蛋白有3 265个，约占总蛋白的58%(图 2c)。相应地，特异性肽段的值越大，对应的特异性谱图的值也较大(图 2d)。这些结果表明检测到的蛋白可信度较高。

Figure 2.  The basic information of the identified proteins of the kernel oil body of V. fordii

GO注释主要是对蛋白质的生物过程(Biological process)、细胞组分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)进行分析。利用Blast2GO软件将所有鉴定到的蛋白质与NR数据库进行比对，得到相应的GO功能注释(图 3)。在生物过程方面，注释结果显示5 632个蛋白主要在催化活性(Catalytic activity)和结合活性(Binding)中富集，可以通过与ATP、GTP、DNA、RNA和金属离子的结合来发挥功能；在细胞组分方面，蛋白主要富集在细胞(Cell)、膜(Membrane)和细胞器(Organelle)中；在分子功能方面，鉴定到的蛋白主要参与代谢过程(Metabolic process)、细胞过程(Cellular process)和单细胞过程(Signal-organism process)，它们的占比分别为46.5%、41.3%和20.1%。

Figure 3.  The GO function annotation analysis of the identified proteins in kernel oil body of V. fordii

在鉴定到的5 632个蛋白中，有催化活性的蛋白2 639个, 其中，包括脂肪酸合成和油脂合成的一系列酶，包括乙酰-CoA羧化酶、油3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、酰甘油酰基转移酶(DGAT)、基-CoA合成酶(FATP1)、脂酰-ACP还原酶(KAR)、脂二酰甘油酰基转移酶2(PDAT)、脂酰-ACP去饱和酶、-酮脂酰-ACP合成酶、基-ACP硫酯酶、4-二烯酰-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶、3-羟酰-CoA脱氢酶、丙二酰-CoA脱羧酶、β-羟酰基酰基载体蛋白质脱水酶、类固醇脱氢酶、烯酰-CoA水合酶、长链脂肪酸CoA连接酶、质体1-酰基甘油磷酸酯酰基转移酶等；其次，还包括脂转运和代谢相关的蛋白，包括磷脂酶、酰基载体蛋白、脂肪酸脱氢酶、鲨烯合酶、羧酸酯酶、3-氧酰酰-[酰基载体蛋白]合酶、鞘氨醇激酶、酰基-CoA氧化酶、酰基-CoA脱氢酶、短链脱氢酶、乙酰-CoA羧化酶羧基转移酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶等，其中，乙酰-CoA羧化酶是脂肪酸合成途径的限速酶，甘油3-磷酸酰基转移酶(GPAT)和二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是油脂合成途径中的关键酶，它们的调控可能增强油脂的积累；同时，在5 632个蛋白中共鉴定出4个油质蛋白(Oleosin)(Unigene27814_All、Unigene22642_All、CL11909.Contig2_All、Unigene116694_All，分子量分别为16.66、14.01、17.81、9.07 kD)。鉴定到的蛋白质涉及了桐油脂质生物合成、代谢和油体组装过程的主要酶，为进一步研究林木特殊油脂的合成奠定了基础。

KEGG注释结果显示：4 541个油体蛋白质在KEGG数据库中有功能注释，共参与了135条代谢通路，其中，最主要的代谢通路是代谢途径和次级代谢物生物合成，分别有1 292(28.45%)和752(16.56%)个蛋白参与。另外，有401个非冗余(598个冗余)的蛋白质参与了脂质的合成、代谢和转运等27条代谢途径(表 2)。

将OB1a/OB2a、OB1a/OB2b、OB1b/OB2a、OB1b/OB2b、OB2a/OB3a、OB2a/OB3b、OB2b/OB3a、OB2b/OB3b、OB1a/OB3a、OB1a/OB3b、OB1b/OB3a、OB1b/OB3b、OB1b/OB1a、OB2b/OB2a、OB3b/OB3a这15个组合以及OB1/OB2、OB1/OB3、OB2/OB3这3个组合设置为比较组，利用IQuant软件对鉴定到的蛋白质进行定量。2次重复实验的最终显著差异蛋白以Fold change>1.2(单次实验比较组比值的平均值)和P-value < 0.05两个条件筛选，最终得到的显著差异蛋白见图 4。

Figure 4.  The differential expressed proteins of the kernel oil body in different comparison groups

在油桐种仁成熟的OB1、OB2和OB3这3个生长时期中，共有3 430个油体蛋白的表达量发生了显著变化。OB1-vs-OB2中有2 197个差异蛋白，其中，1 170个蛋白质上调，略多于下调蛋白质的数目。与OB1-vs-OB2相比，OB2-vs-OB3的差异蛋白数目(1 537)相对较少，其中，56.7%(872)的蛋白下调(图 4)。OB1-vs-OB2和OB2-vs-OB3的共同差异蛋白有712个，在种仁成熟的这3个生长时期中，表达量连续升高的蛋白有125个，表达量连续降低的蛋白有48个(图中未列出)。

利用变异系数(CV)来评估定量的重复性。当越小的CV值覆盖到越多的定量蛋白时，认为其重复性越好。图 5横坐标为CV值，纵坐标为小于CV值的蛋白数量占整个定量蛋白数量的百分比。如图 5a所示：当CV < 0.4时，OB1-vs-OB2可覆盖到95%的定量蛋白。如图 5b所示：当CV < 0.3时，OB2-vs-OB3可覆盖到94%的定量蛋白。如图 5c所示:当CV < 0.4时，OB1-vs-OB3可覆盖到95%的定量蛋白。说明2次重复实验的重复性比较好。

Figure 5.  The CV distribution analysis of the repeatability

OB1-vs-OB2、OB1-vs-OB3和OB2-vs-OB3中的油体差异蛋白在细胞组分和生物过程中主要的GO富集结果是相同的：在细胞组分中，油体差异蛋白主要在细胞、细胞内以及内质网中富集。在生物过程中，差异蛋白主要在代谢过程和细胞转化中富集。但在分子功能方面，3个时期的油体差异蛋白的富集结果却不尽相同。OB1-vs-OB2、OB1-vs-OB3中的差异蛋白主要在催化活性和结合活性中富集；但在OB2-vs-OB3中，差异蛋白却不在催化活性这一分子功能上富集(表 3)。

油体差异蛋白的Pathway富集分析发现，OB1-vs-OB2差异蛋白主要的富集通路是RNA转运(RNA transport)、核蛋白体(Ribosome)和吞噬小体(Phagosome)的代谢(图 6a)。OB1-vs-OB3差异蛋白主要的富集通路为次生代谢物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)、核蛋白体和剪接体(Spliceosome)的代谢(图 6b)。OB2 vs. OB3差异蛋白富集的通路较多，主要包括内质网蛋白质加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)、丙酮酸代谢(Pyruvate metabolism)、柠檬酸循环(TCA cycle)、苯丙醇生物合成(Phenylpropanol biosynthesis)和不饱和脂肪酸的生物合成(Biosynthesis of unsaturated fatty acids)等(图 6c)。

Figure 6.  The KEGG pathway enrichment analysis of the differential expressed proteins of kernel oil body

在油桐种仁的3个生长时期中，有401个非冗余蛋白质参与了脂质的合成及代谢途径(表 2)。在OB1-vs-OB2比较组中，有135个脂质合成与代谢相关的蛋白质的表达量发生了显著性变化，其中, 有44个具有功能注释的蛋白质参与了脂肪酸的合成与代谢。对这44个蛋白质和其它4个油质蛋白(Unigene27817_All、Unigene22642_All、Uingene116694_All、CL11909.Contig2_All)进行了聚类分析(图 7)。

Figure 7.  The cluster analysis of the differential expressed proteins involved in the fatty acids metabolism

图 7表明：参与脂肪酸代谢的酰基辅酶A氧化酶(CL14770.Contig1_All、CL25395.Contig1_All)和DAG蛋白(CL23974.Contig1_All)以及参与油质贮藏的4个油质蛋白的表达量在油桐种仁3个不同发育时期中均有显著变化。这几个差异蛋白的表达量在这3个生长时期表现出先升后降的趋势。相比于OB1时期, 它们的表达量在OB2时期显著升高；而相比于OB2时期，它们的表达量在OB3时期又显著下降。

我国是世界上最大的桐油生产国，年产量达10万t以上，占世界桐油产量的80%^[19]。随着油桐应用领域的不断扩大以及人类对植物油脂需求的日益增长，桐油的产量已经不能满足世界市场的需求。决定桐油性质的桐酸等脂肪酸储存在油体中，因此对不同生长时期种仁油体蛋白质组进行分析可以为油脂合成和油体装配的分子机理研究奠定基础。

作者利用改良的方法对油桐种仁油体蛋白进行了提取，以去除干扰蛋白质提取的多种次生代谢物质，然后采用iTRAQ技术，对油桐种仁成熟期3个不同生长阶段(8月初至9月末)的油体蛋白进行了定量分析。鉴定得到的5 632个油体蛋白的分子量，氨基酸肽段长度和特异性肽段数目的统计分析以及iTRAQ定量的重复性检验均表明测得的数据质量较高。GO功能注释分析发现，5 632个油体蛋白中有2 639个具有催化活性，这包括催化脂肪酸以及油脂合成与代谢、脂质转运与储存、油体装配的一系列酶。KEGG通路分析发现，有401个非冗余油体蛋白直接参与了与脂质代谢相关的27条代谢途径。iTRAQ定量分析发现，在油桐种仁3个不同发育时期中有3 430个显著差异表达的蛋白，其中，OB1-vs-OB2的差异蛋白数目最多，而OB2-vs-OB3的差异蛋白数目最少。差异蛋白的KEGG富集分析发现，虽然OB2-vs-OB3差异蛋白的数目最少，但富集的代谢途径却较多。差异蛋白的GO富集分析发现，在OB1-vs-OB2中富集的催化活性这一分子功能在OB2-vs-OB3中却不富集，这说明第3个时期与第2个时期相比，具有催化活性的蛋白的表达量没有发生显著变化。已知具有催化活性的蛋白包含一些调控脂肪酸、油脂合成及代谢的酶，这些酶的表达量的非显著变化也许导致了桐油和桐酸含量积累的减慢。这与油桐桐油及桐酸含量的变化趋势一致，即8月中旬至9月中旬是油脂积累的高峰期，桐油的含量和脂肪酸中桐酸的含量上升，侧重于脂肪的积累、转化和种胚的成熟^[20]；而9月下旬，油脂含量几乎不再增加。因此，作者重点关注在OB1-vs-OB2中表达量发生显著变化的差异蛋白。在直接参与脂质合成与代谢的401个差异蛋白和4个油质蛋白中，有135个蛋白在这个阶段是显著变化的。脂肪酸代谢途径与脂质相关的48个差异蛋白的聚类分析发现，酰基辅酶A氧化酶、DAG蛋白和4个油质蛋白的表达量均在桐油和桐酸积累时期显著上升，而在桐油和桐酸稳定时期显著降低，这说明这几个差异蛋白在调控油脂合成、代谢和贮藏中可能发挥着关键作用，进一步证实了油质蛋白是油体结构组成和功能调节最主要的蛋白^[16]。

本试验基于iTRAQ定量技术对不同生长时期的油桐种仁油体蛋白质组进行了鉴定及差异分析，研究发现，酰基辅酶A氧化酶、DAG蛋白和4个油质蛋白可能在调控油脂合成、代谢与转运以及在油体装配中发挥着关键作用，为阐明木本植物特殊油脂生物合成分子机制和深入实施木本油料植物分子育种提供了新的策略与理论依据。