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油茶(Camellia oleifera Abel.)为山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia L.)常绿小乔木或灌木[1]，与油桐(Vernicia fordii (Hemsl.) Airy Shaw)、乌桕(Sapium sebiferum L.)和核桃(Juglans regia L.)并称为我国四大木本油料植物。目前，全国现有油茶林面积400万hm2，年产茶油近5.4亿kg，茶油被誉为“油中软黄金”[2]，其不饱和脂肪酸含量在90%以上，主要为油酸和亚油酸，还有少量高价不饱和脂肪酸，营养丰富，集食用价值和医疗保健功用于一身[3-4]。
高州油茶(Camellia gauchowensis Chang)又名越南油茶、大果油茶，是我国油茶南缘品种，主要分布于广东和广西，以其树形高大、果实大、产量高著称[5-6]，但其现有人工林大小年明显，落花落果现象严重，单株间的产果率差异大，没有发挥其高产的潜力。目前，对高州油茶的研究多集中在育苗、引种和栽培上[7-13]，而对高州油茶生殖生理及调控机制的研究较缺乏。花粉是植物携带遗传信息的生殖细胞，是种质保存和交换的重要资源[14-15]，研究花粉特征对揭示高州油茶生殖生理有重要意义。本研究以高州油茶为试验材料，研究其花粉数量、花粉形态、花粉养分含量及花粉贮藏特征，旨在为高州油茶的人工授粉、杂交育种提供理论和技术参考。
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试验地位于广东省揭阳市林科所的揭东区新亨镇新西河水库库区的油茶试验地(116°17′E，23°41′N)。该地属亚热带季风气候，日照充足，年平均气温21.4℃，平均降水量1 720~2 100 mm。试验林总面积30 hm2，为20世纪70年代初采用高州油茶实生苗栽植的人工林，林地总体坡向西北, 坡度30~40°，土壤类型为山地黄红壤。目前该林分管理条件好，总体生长良好。
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在试验区内进行全林踏查后，为使采样树具有随机性和代表性，分别在上、中、下坡选择具有代表性的地段内设置3个样地，每个样地面积为20 m×20 m；在每个样地内选择生长旺盛、无病虫害的采样树10株，共30株，做好标记，并测定记录采样株的树高、冠幅等生长指标。
于2016年12月中旬，高州油茶进入盛花期阶段，采摘即将开放的花苞，保鲜处理后带回实验室进行水培，待花开放后，取出花药，在硫酸纸上收集花粉备用。
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采用纤维素酶法[16]测定花粉数量。具体方法和步骤：采集待开的50朵花苞，分别取完整花药10枚放入5 mL离心管中，置于25℃下烘干，待其花粉完全散出后，加入1%纤维素酶1 mL，在25℃下处理24 h，充分振荡后用微量移液枪吸取5 μL溶液滴于载玻片上，在OLYMPUS BX-51显微镜下观察统计，重复3次。计算公式如下：
式中：M为每枚花药花粉量(粒·花药-1)，m表示载玻片上总花粉粒数。
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花粉形态采用扫描电镜(SEM)观测，将24 h内自然散出的花粉均匀挑到粘有双面胶的样品台上，在离子溅射仪中真空喷金镀膜，置于LEO 1530VP扫描电子显微镜下观察，选取有代表性的视野分300倍(群体)、500倍(群体)、1 500倍(个体)、2 000倍(个体)、10 000倍(局部)进行拍照，各取典型花粉20个测量其极轴长、赤道轴长，并观察、记录花粉表面纹饰；同时采集油茶优良品种‘岑软2号’(属普通油茶)的花粉作对照。
花粉形态的描述主要依据《孢粉学概论》中的名词术语和定义。
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取高州油茶花粉和‘岑软2号’花粉干样，分别测定其N、P、K、Ca、Mg、Zn、B的养分含量。全N采用硫酸-双氧水消煮-蒸馏滴定法；全P采用硫酸-双氧水消煮-钒钼黄比色法；全K采用硫酸-双氧水消煮-火焰原子吸收分光光度法；Ca、Mg、Zn采用干灰化-稀盐酸溶解-火焰原子吸收分光光度法；B采用干灰化-稀盐酸溶解-姜黄素比色法。
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采集即将开放的花苞，取出花药，于25℃烘箱中烘12 h以上，直到花粉完全散出。收集花粉，用西林瓶保存，使用硅胶干燥剂，分别置于25℃恒温、25℃恒温+干燥剂、4℃、4℃低温+干燥剂、-20℃冰冻+干燥剂、-80℃超低温+干燥剂5个处理进行保存，分别在贮藏0、2、5、7、15、30、45、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360 d后用TTC法对其活力进行检测，每处理3个重复。
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本文数据采用Microsoft Excel 2007进行常规分析，采用Origin Pro 8.5进行非线性曲线拟合及绘图。
2.1. 采样树选择及样品采集
2.2. 花粉数量测定
2.3. 花粉形态观察
2.4. 花粉养分含量测定
2.5. 花粉贮藏特性
2.6. 数据处理与分析方法
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高州油茶单枚花药的花粉量为950~6 450粒，平均为2 699粒，单枚花药花粉数在1 000~2 000、2 000~3 000粒区间的花朵数最多，分别为16、15朵，共占总数的62%。从2 000~3 000粒至6 000~7 000粒，花朵统计数逐渐减少，6 000~7 000粒区间的花朵数仅1朵。
将单枚花药花粉数以组距1 000可划分为6组，以区间中值表示其所在区间，如500代表[0~1 000)，单枚花药花粉数频数分布见图 1。对其进行非线性曲线拟合结果表明：单枚花药花粉数的分布规律强，单枚花药花粉数的频数分布服从正偏态分布，拟合函数为：
Figure 1. The number distribution of single anther pollen
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单花花粉量为85 680~1 419 000粒，平均为461 186粒。单花花粉数在40~60万粒区间的分布最多，统计数为16朵，其次为20~40万粒和0~20万粒区间，100~120万粒和120~140万粒区间的统计数最少，分别只有2朵和1朵。
将单花花粉数以组距20万粒可划分为7组，区间中值表示其所在区间，如10万粒代表[0~20万粒)，单花花粉数的频数分布见图 2。通过对其进行非线性曲线拟合，发现单花花粉数的分布规律较强，单花花粉数服从正偏态分布，拟合函数为：
Figure 2. The number distribution of single flwer pollen distribution
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‘岑软2号’的花粉为等极或辐射对称(图 3)，外形为长球形，极轴长(P)/赤道轴长(E)变幅为1.55~1.95，极面观为三裂圆形(图 3e)，赤道面观为长椭圆形(图 3c)。极轴长平均47.73 μm，变化范围为39.73~52.92 μm；赤道轴长平均26.87 μm，变化范围为22.65~32.04 μm。按王开发的分级标准[17]，‘岑软2号’的花粉属于中等大小花粉(花粉最长轴为25~50 μm)。‘岑软2号’的花粉萌发孔在正常状态下为三(拟)孔沟型，沟细长近达两极，多具隐沟型。花粉粒将近萌发时, 出现萌发沟变宽、中部突起，花粉粒由近球形横向发展，萌发沟分别由中部向外突出，变为棱锥形(图 3d)。花粉外壁表面纹饰为皱波状(图 3f)，网脊凸出非常明显，网眼为圆形或近圆形。在观察中发现，‘岑软2号’具少量凸出条纹状纹饰花粉(图 3b)，形态与其他花粉形态差异明显。
Figure 3. The pollen morphology of C. oleifera 'CenRuan 2'
扫描电镜结果显示：高州油茶花粉为等极或辐射对称(图 4)。花粉外形呈长球形，花粉粒的P/E变幅为1.34~1.77，赤道面观为长椭圆形(图 4c)，极面观为三裂圆形(图 4e)。极轴长48.51 μm，变化范围为44.66~54.08 μm；赤道轴长30.45 μm，变化范围为27.38~34.29 μm。按王开发的分级标准[17]，高州油茶的花粉也属于中等大小花粉(花粉最长轴为25~50 μm)。在扫描电镜下观察，高州油茶的花粉萌发孔在正常状态下为三(拟)孔沟型，沟细长近达两极，多具隐沟型。花粉粒将近萌发时, 出现萌发沟变宽、中部突起，花粉粒由近球形横向发展，萌发沟分别由中部向外突出，变为棱锥形(图 4d)，与‘岑软2号’相似。花粉外壁表面纹饰为穴网状(图 4f)，由突起的网脊和网眼组成，网脊较为凸出，网眼径宽0.2~1.0 μm，大小不规则且分布不均匀。
Figure 4. The pollen morphology of C.gauchowensis Chang
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油茶花粉中养分含量丰富，高州油茶和‘岑软2号’的全N、全P、全K、全Ca、全Mg、全Zn、全B的养分含量测定结果(表 1)表明：高州油茶花粉的全N、全P、全K、全Ca、全Mg含量与‘岑软2号’差异不大，全N含量和全Mg含量比‘岑软2号’略高，分别比‘岑软2号’多11.83%和11.93%，而全P、全K、全Ca分别比‘岑软2号’少11.86%、7.29%和14.91%；高州油茶花粉全Zn的含量与‘岑软2号’差异明显，高州油茶比‘岑软2号’多77.34%；高州油茶花粉全B的含量明显低于‘岑软2号’，高州油茶比‘岑软2号’低51.34%。
养分元素 高州油茶 岑软2号 相对误差/% 全N/(g·kg-1) 58.72 52.51 11.83 全P/(g·kg-1) 7.73 8.77 -11.86 全K/(g·kg-1) 8.65 9.33 -7.29 全Ca/(g·kg-1) 1.94 2.28 -14.91 全Mg/(g·kg-1) 1.22 1.09 11.93 全Zn/(mg·kg-1) 135.93 76.65 77.34 全B/(mg·kg-1) 2.73 5.61 -51.34 Table 1. The content of pollen nutrient elements in C. gauchowensis Chang and C. oleifera 'CenRuan 2'
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在不同贮藏方式下，高州油茶花粉的生活力变化(图 5)表明：花粉活力的变化曲线总体呈下降趋势。花粉收集当天，花粉生活力较高，达90.25%；随着花粉贮藏时间的增加，花粉活力有所下降。
Figure 5. The pollen viability under different storage methods
花粉贮藏2 d后，各处理的花粉生活力均有所下降，其中，4℃干燥、-20℃干燥、-80℃干燥的降幅最小，花粉生活力均在85%以上；其次是25℃干燥和4℃非干燥，分别下降至78.05%和76.61%；生活力下降幅度最大的是25℃非干燥，贮藏2 d时，花粉生活力为55.28%。
花粉贮藏5 d后，4℃干燥、-20℃干燥、-80℃干燥、25℃干燥和4℃非干燥的花粉生活力都没有太大波动，与贮藏2 d的生活力相近；而25℃非干燥处理的花粉生活力骤降，仅为15.95%。
花粉贮藏7 d后，25℃非干燥处理的花粉生活力继续下降，仅为9.51%；其他几个处理的花粉生活力变化仍无较大波动，25℃干燥处理花粉的生活力还出现了略有上升的情况；
花粉贮藏15 d后，25℃非干燥的花粉已基本没有生活力；25℃干燥和4℃非干燥的花粉生活力略有降低，分别降低了4.73%和1.07%。
花粉贮藏30 d后，25℃干燥和4℃非干燥的花粉生活力骤降，25℃干燥的花粉生活力为53.86%，而4℃非干燥花粉的生活力仅为39.25%；4℃干燥、-20℃干燥、-80℃干燥的花粉生活力仍保持在80%以上，其生活力分别为82.02%、84.60%和87.54%。
花粉贮藏45 d时，25℃干燥和4℃非干燥的花粉生活力继续下降，4℃非干燥花粉的生活力下降最快，此时仅为0.56%；25℃干燥的花粉生活力下降至28.61%；4℃干燥、-20℃干燥、-80℃干燥的花粉生活力无明显波动，分别为82.94%、86.26%和88.35%。
花粉贮藏60 d后，25℃非干燥和4℃非干燥的花粉活力均为0，25℃干燥的花粉生活力为11.58%，而4℃干燥、-20℃干燥、-80℃干燥的花粉生活力仍保持在80%以上。可见，干燥、低温的条件是高州油茶花粉贮藏的必要条件。
花粉贮藏90 d后，25℃干燥花粉生活力降为0；而4℃干燥、-20℃干燥、-80℃干燥的花粉生活力均保持在80%左右。
花粉贮藏120 d后，4℃干燥、-20℃干燥、-80℃干燥的花粉生活力均有所下降，分别降低了9.55%、5.79%、3.62%。
花粉贮藏150 d后，4℃干燥、-20℃干燥、-80℃干燥的花粉生活力下降到58.79%、68.65%、72.99%。
花粉贮藏180 d后，4℃干燥、-20℃干燥、-80℃干燥的花粉生活力下降到42.58%、62.73%、68.07%。
花粉贮藏210 d后，4℃干燥花粉生活力骤降了24.34%，-20℃干燥、-80℃干燥的花粉生活力平缓下降到58.91%、63.87%。
花粉贮藏240 d后，4℃干燥的花粉生活力降为0；-20℃干燥、-80℃干燥的花粉生活力均保持在50%以上。
花粉贮藏270 d后，-20℃干燥、-80℃干燥的花粉生活力持续下降，分别降低了5.70%、2.68%。
花粉贮藏300 d后，-20℃干燥、-80℃干燥的花粉生活力下降到42.49%、51.10%。
花粉贮藏330 d后，-20℃干燥、-80℃干燥的花粉生活力分别为37.02%、48.56%。
花粉贮藏360 d后，-20℃干燥、-80℃干燥的花粉生活力下降到31.34%、40.66%。
3.1. 花粉数量
3.1.1. 单枚花药花粉数量
3.1.2. 单花花粉数量
3.2. 花粉形态
3.3. 花粉养分含量
3.4. 花粉贮藏特性
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高州油茶单枚花药的花粉量为950~6 450粒，平均为2 699粒，比何春燕等[18]观察到的越南油茶的花粉数量少，与普通油茶的花粉数量相近。单花花粉数为85 680~1 419 000粒，平均为461 186粒，与王湘南[19]观察到的湘林、赣兴等油茶的单花花粉数相近。单枚花药花粉数和单花花粉数的分布均服从正偏态分布，分布规律性强。
‘岑软2号’花粉与高州油茶的形状相似，都呈长球形，且都属于中等大小的花粉，但高州油茶花粉比‘岑软2号’花粉略大，P/E值比其略小，高州油茶花粉略为细长。2种花粉的表面纹饰差异较大，高州油茶为穴网状，‘岑软2号’为皱波状，且‘岑软2号’表面的网脊更凸出。观察中还发现，‘岑软2号’具有部分形态变异的花粉，表面呈凸出的条纹状纹饰，形态变异的花粉是否与‘岑软2号’高产有关还有待进一步探究。2种油茶的花粉中均存在败育的花粉，败育花粉粒变形大，特征大多表现为形态干瘪、不充实，其发育机理和败育原因尚不清楚，有待进一步研究。高州油茶花粉全Zn含量比‘岑软2号’高77.34%。锌是吲哚乙酸合成所必需的元素，它对生物合成有重要作用，适宜浓度的锌可以促进花粉管的生长，但过高或过低浓度的锌会抑制花粉的萌发[20]。硼有利于促进花粉的萌发与花粉管的生长，高州油茶花粉全B的含量比‘岑软2号’低51.34%。根据测定，高州油茶自然授粉的坐果率仅为4.2%，‘岑软2号’自然授粉的坐果率达85%[21]，高州油茶的坐果率低于‘岑软2号’的原因可能与其Zn和B的含量差异有关。
不同贮藏方式对高州油茶花粉生活力的影响差异显著，不同贮藏方式对油茶花粉保存效果有不同影响。未加干燥剂的处理中，25℃非干燥条件下，花粉在贮藏15 d后失去生活力，而4℃非干燥条件下贮藏45 d后基本失去活力，说明低温比常温条件更有利于其花粉的贮藏[22]。25℃干燥条件下贮藏60 d后花粉生活力为11.58%，比25℃和4℃条件的贮藏时间明显加长，说明干燥条件也是花粉贮藏的必要条件，常温干燥条件甚至比4℃低温不干燥贮藏时间更长。试验中发现，除25℃恒温贮藏外，其他5个处理都满足花粉保存1个月的需要。4℃干燥、-20℃干燥、-80℃干燥3个贮藏条件在保存3个月时花粉能保持80%的活力。4℃干燥的贮藏条件不能满足高州油茶花粉的跨年保存，在贮藏240 d时花粉生活力降为0。-20℃干燥、-80℃干燥2个贮藏条件能够满足高州油茶花粉的长期贮藏要求。因此，低温、干燥条件有利于高州油茶花粉的贮藏，与叶欣[23]、袁德义等[16]的研究结果一致。
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高州油茶单枚花药的花粉量平均为2 699粒，单花花粉数平均为461 186粒；其花粉大小属中等水平，呈长球形，赤道面观为长椭圆形，极面观为三裂圆形，花粉萌发孔在正常状态下为三(拟)孔沟型；高州油茶花粉养分中全N、全P、全K、全Ca的含量与‘岑软2号’的差异不明显，全Zn和全B含量与‘岑软2号’的差异明显；低温、干燥条件有利于高州油茶花粉的贮藏，4℃干燥贮藏60 d后花粉生活力保持在80%以上，-20℃干燥、-80℃干燥贮藏360 d后花粉生活力仍在30%以上。
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