Analysis on the Nutrients and Bioactive Components of Petals in Different Floral Stages of Camellia nitidissima

2018年1月于广西南宁市金花茶公园采集金花茶花朵，分别用锡箔纸包裹，于液氮中速冻带回实验室，-80℃超低温冰箱保存备用。根据金花茶发育过程中花蕾和花朵典型形态特征，将其划分为花蕾期、半开期、盛开期和初谢期(表 1、图 1)。

Figure 1.  Floral buds and flowers of C. nitidissima

安捷伦1290液相色谱仪(美国Agilent公司)；日立L-8900氨基酸分析仪(日本Hitachi公司)；AA6800原子吸收分光光度计(日本Shimadzu公司)；万通MIC-5离子色谱仪(瑞士万通公司)；Thermo Scientific^TM Multiskan^TM GO全波长酶标仪(美国赛默飞世尔公司)；Eppendorf Centrifuge 5804 R冷冻离心机(德国艾本德公司)；Sartorius BT224S电子天平(德国赛多利斯公司)；FreeZone^®冷冻干燥机(美国Labconco公司)；Thermo Scientific 902超低温冰箱(美国赛默飞世尔公司)。

参考文献[12-13]，采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定，根据样品及实验情况略有修改。精确称取金花茶花瓣干燥样品0.2 g，放入15 mL离心管中，加入65%乙醇提取液10 mL，65℃恒温浸提4 h，4℃、3 500 r·min^-1离心10 min，吸取上清液，残渣重复浸提2次至样品颜色泛白，合并3次上清液，混匀备用。准确移取样品提取液1 mL，放置于10 mL的具塞试管中，进行显色反应。按照芦丁标准曲线绘制方法于510 nm测定吸光度，计算总黄酮的含量。

参照GB/T 8313-2008^[14]，采用比色法测定，以没食子酸为标准品计算样品中多酚含量。

参照GB/T 5009.8-2016^[15]，采用高效液相色谱法测定。色谱条件：流动相为乙腈:水=70:30 (v/v)，流速：1.0 mL·min^-1，柱温：35℃，示差折光检测器：温度35℃，进样量：20 μL，色谱柱：Inertsil ODS-SP (250 mm×4.6 mm, 5 μm)。

参照GB/T 5009.86-2016^[16]，采用高效液相色谱法测定。色谱条件：流动相为0.1%磷酸:100%甲醇=98:2 (v/v)，流速：1.0 mL·min^-1，柱温：30℃，二极管阵列检测器，检测波长：245 nm，进样量：20 μL，色谱柱：Inertsil ODS-SP (250 mm×4.6 mm, 5 μm)。

参照GB/T 5009.88-2014^[17]，采用酶解法测定。金花茶花瓣粉末经冷冻干燥、脱脂、脱糖处理后进行酶解反应去除蛋白质和淀粉，将所得酶解液进行沉淀、抽滤、洗涤，得残渣质量，去除蛋白质和灰分质量，得总膳食纤维含量。

参照GB/T 5009.124-2016^[18]，采用茚三酮柱后衍法测定。金花茶花瓣试样匀浆后用6 mol·L^-1盐酸溶液水解，将水解液浓缩蒸干，加柠檬酸钠缓冲液溶解后测定。

参照LY/T 1270-1999^[19]，采用湿灰化法测定Ca、Mg、K、Na、Fe、Cu、P、S、Zn、Mn含量，试样加硝酸与高氯酸消煮后测定。Cr、Se、Ni、Sn含量参考文献[20]采用电感耦合等离子体质谱法测定，试样加硝酸和30%过氧化氢于消解罐内，经微波消解炉消解后测定。Cl^-含量参考文献[21]采用离子色谱法测定，试样用甲醛和0.01 mol·L^-1氢氧化钠溶液提取，上清液过膜测定。

每个样品重复测定3次，均以干物质质量计算含量，结果表示为平均值±标准差。用Excel 2003软件对实验数据进行平均值、标准差和变异系数(Coefficient of variance, CV)计算，CV =标准差/平均值×100%^[22]；利用SPSS19.0软件进行差异显著性分析，运用Origin 8.0软件绘图。

从表 2可以看出，从花蕾期到初谢期，金花茶花瓣总黄酮含量变化幅度为10.9%~11.5%，平均值11.1%，4个时期含量比较稳定，呈平缓下降趋势；花瓣总多酚含量变化幅度为1.47%~1.73%，平均值1.59%，花蕾期和半开期较低，在盛开期和初谢期达到峰值；总膳食纤维含量比较稳定，变化幅度53.2%~57.3%，平均值54.9%，盛花期达到峰值；抗坏血酸含量变异系数较大，为36.0%，随着花蕾不断生长、张开，其从0.411 mg·g^-1急剧降至0.174 mg·g^-1，降幅达57.7%。

不同时期的金花茶花瓣可溶性糖组分及其含量见图 2。金花茶花瓣中可溶性糖包括蔗糖、葡萄糖、果糖3种。可溶性糖总量4个时期的平均值22.86%，排序为盛开期(30.41%)>花蕾期(21.23%)>半开期(20.72%)>初谢期(19.06%)，盛开期达到峰值。果糖含量最高且变化较大，变化幅度11.50%~18.57%，平均值13.42%；花蕾期、半开期和初谢期果糖较低，在盛开期达到最大；葡萄糖含量次之，变化幅度6.21%~10.80%，平均值8.15%，不同时期的变异趋势与果糖一致；蔗糖含量最低，平均值1.28%，变化幅度1.04%~1.64%，含量较稳定，半开期略高。

Figure 2.  Compositions and contents of soluble sugars in petals at different stages of C. nitidissima

在金花茶4个不同发育时期花瓣中共检测出17种水解氨基酸，包括人体必需氨基酸7种(表 3)。从花蕾期到初谢期，花瓣中氨基酸总量(Total amino acid, TAA)依次为2.92%、2.61%、2.52%、2.23%。在金花茶花蕾生长、盛开及凋谢过程中，TAA随之降低，初谢期与花蕾期相比，降幅达23.63%。其中含量较高的氨基酸组分是谷氨酸(0.307%)、天冬氨酸(0.277%)、亮氨酸(0.267%)和赖氨酸(0.211%)。17种水解氨基酸在4个不同发育时期中的变化趋势可归为以下3种类型：初低-中高-后低下降型(胱氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸)；起伏缓慢下降型(脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、赖氨酸)；线性平缓下降型(谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸等10种)。金花茶花蕾期、半开期、盛开期和初谢期花瓣中必需氨基酸/总氨基酸变化幅度40.9%~41.8%，非常稳定；必需氨基酸/非必需氨基酸也十分稳定，其含量平均高达70.9%。

在金花茶不同发育时期花瓣中共检测了15种矿质营养元素的含量，包括7种常量元素和8种微量元素。由表 4可以看出，从花蕾期到初谢期，金花茶花瓣中含量最高的常量元素为K，平均值高达11.6 g·kg^-1，变化幅度10.3~12.7 g·kg^-1，在盛开期达到峰值；其次是Ca，平均值2.66 g·kg^-1，在初谢期达到峰值2.97 g·kg^-1，但变化幅度较小；然后是Mg，变化幅度1.53~1.78 g·kg^-1，平均值为1.67 g·kg^-1，4个时期的含量稳定。花瓣中含量较低的常量元素是Na、Cl，Na低至0.126 g·kg^-1，变化幅度0.094 2~0.160 g·kg^-1；金花茶花蕾发育成熟、盛开及凋谢过程中，Cl从0.149 g·kg^-1降至0.097 9 g·kg^-1。花瓣中K含量约为Na含量的80倍，表现为高K低Na的特征。

由表 5可以看出，金花茶花瓣中的主要微量元素为Mn、Fe和Zn。从花蕾期到初谢期，Mn含量变化呈起伏上升趋势，变化幅度141~227 mg·kg^-1，平均值188 mg·kg^-1；Fe含量变化最大，呈“V”变化趋势，其幅度为19.4~76.0 mg·kg^-1，平均值38.4 mg·kg^-1，变异系数高达67.96%；Zn含量变化较大，也呈“V”变异趋势，其幅度为4.42~8.67 mg·kg^-1，平均值5.93 mg·kg^-1；3种主要微量元素均在初谢期达到峰值。花瓣中Se含量最稳定，变化幅度0.040 2~0.048 9 mg·kg^-1，平均值0.044 7 mg·kg^-1，在盛开期达到峰值。

金花茶4个特征发育时期中，花瓣的总黄酮含量排序为花蕾期>盛开期>半开期>初谢期，随着花蕾生长和张开，呈现平缓下降趋势；总多酚、可溶性糖含量和总膳食纤维含量均在盛开期最高；总多酚、可溶性糖和总膳食纤维在金花茶植株内随着花芽的发育成熟逐渐积累，在盛花期达到峰值，待花朵开始凋谢，这些成分的分解量大于积累量，且花朵含水量上升，所以整体含量均呈现下降趋势。抗坏血酸容易氧化分解，其含量则急剧下降；水解氨基酸不同种类的变异类型虽有差异，但17种氨基酸总含量仍呈现明显线性下降趋势；7种常量元素含量在盛开期达到峰值；8种微量元素总含量在初谢期达到峰值，明显高于前3个时期，与常量元素相比表现一定的滞后现象。考虑到花蕾较小，而盛开期花朵质量达到最大，因此，金花茶在盛开期营养成分及生理活性成分达到峰值，无论从营养成分含量，还是花朵质量衡量，均是最适采摘期。金花茶花蕾营养丰富，特别是花蕾期抗坏血酸含量最高，8种微量元素含量仅次于初谢期，比盛开期和半开期分别高22%~31%，考虑到花蕾的特殊形态，也是制作金花胎茶的理想采收期。

与扶绥中东金花茶(C. achrysantha Chang et S. Y. Liang)花朵相比^[7]，金花茶总黄酮含量高于扶绥中东金花茶，但总多酚要低于扶绥中东金花茶；与毛瓣金花茶(C. pubipetala Wan et Huang)花朵相比^[23]，金花茶的总黄酮高于毛瓣金花茶，但多酚和抗坏血酸含量较毛瓣金花茶低。本研究中金花茶花瓣总黄酮、总膳食纤维和抗坏血酸含量均高于金花茶的叶片^[24-26]，其中总黄酮含量是金花茶成熟叶的18倍，但多酚含量较叶片低；与茶树(C. sinensis (L.) O. Ktze.)的花朵相比^[27-28]，金花茶的总多酚含量(1.59%)低于茶树花朵总多酚含量(2.41%)，但总黄酮含量(11.1%)、可溶性糖含量(22.86%)和氨基酸含量(2.57%)远高于茶树花朵(3类成分含量分别为0.62%、0.63%、0.503%)；除多酚外，金花茶花瓣其它营养成分及生物活性成分含量也较高。李石容^[8]测定金花茶花朵总黄酮含量为13.7%，略高于本研究结果(11.1%)，前者对黄酮类化合物进行了初步分离纯化，消去了些杂质。林华娟等^[10]测定了金花茶盛开期花朵的黄酮类、茶多酚、抗坏血酸含量分别为8.5%、4.42%、0.09%，比本研究中黄酮含量明显偏低，但多酚和抗坏血酸含量显著偏高，这可能与两者采用的测定方法不同有关。唐建民等^[11]测定金花茶花蕾、开放花和初谢花中的黄酮、多酚、可溶性糖、抗坏血酸及粗纤维含量，花蕾黄酮含量低于本研究结果，但开放花和初谢花黄酮含量、多酚、可溶性糖和抗坏血酸含量高于本结果，这些差异可能与两者样品采集时间、样品前处理方式，以及测定方法和计算基准(鲜质量与干鲜程度)的不同有关。

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是营养评价的主要指标^[29]。金花茶花瓣中氨基酸组分构成合理，含量丰富，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和赖氨酸组分含量较高。金花茶4个发育时期花瓣中必需氨基酸/总氨基酸均高于40%，必需氨基酸/非必需氨基酸均高于60%，已符合FAO/WHO规定的人体所需理想蛋白质模式^[30]。因此，可针对相应的功能，利用金花茶花瓣开发多种氨基酸复合剂，为人体补充所需的氨基酸。谷氨酸和天冬氨酸含量高可增加金花茶冲泡花茶的鲜爽口感；酚/氨比(茶多酚与氨基酸比值)也是考察制茶适宜性的重要指标^[10]，4个时期金花茶花瓣的酚/氨比为5.07、5.63、6.87、7.53，均低于8.00，与唐建民等^[11]研究一致，适宜制作天然清香味的花茶。

矿质元素是人体不可或缺的营养物质。金花茶花瓣中含量较高的常量元素为K(12.7 g·kg^-1)、Ca(2.97 g·kg^-1)、Mg(1.78 g·kg^-1)。K含量约为Na含量的80倍，与毛瓣金花茶花朵^[23]、金花茶叶片^[24-26]同样都具有高钾低钠的典型特征。金花茶花瓣中含有丰富的K、Ca、Mg，可开发电解质运动饮料，饮料中的电解质有益于调控运动后人体血液离子平衡和水平衡，维持水盐代谢平衡^[31]。微量元素也对人体有着不可忽视的作用，缺少微量元素会影响人体神经系统、免疫功能，造成内分泌失调等不良后果^[32]。金花茶初谢期花瓣中Fe元素含量较高(76.0 mg·kg^-1)，远高于毛瓣金花茶花朵(15.5 mg·kg^-1)^[23]和金花茶叶片^[24-25]，但Zn含量稍低于后两者；金花茶花瓣中Se含量较为丰富(0.048 9 mg·kg^-1)且稳定，具有一定的富集硒元素的功能，是毛瓣金花茶(0.004 mg·kg^-1)^[23]的10倍，使金花茶花瓣具有比其它金花茶物种更好的协同保健功能。

总黄酮、总多酚是金花茶花朵中最重要的生物活性成分，可以清除自由基，具有抗衰老、抗氧化、增强机体免疫力、抗菌除臭等功能^[33-34]。抗坏血酸具有较强的抗氧化功能，随着温度升高和光照增强均会引起其自身氧化分解，故在花朵生长过程中会有明显的流失。金花茶花瓣中含有较高的膳食纤维，膳食纤维不易被人体内的消化酶所消化^[35]，高膳食纤维食品可促进肠道蠕动，因而具有改善人体消化系统的功能，可用于开发预防便秘等功能性食品。

4个发育时期中，金花茶花瓣生物活性成分以及营养成分含量存在着差异，花瓣中生物活性成分含量排序为全开期＞花蕾期＞半开期＞初谢期，而其它营养成分含量排序为全开期＞初谢期＞半开期＞花蕾期。综合分析结果表明，金花茶盛开期花瓣的营养成分及生物活性成分丰富且全面，协同性好，能够满足人体的需要，利于机体吸收，有较高的营养价值，可用于研发对人体有益的多种功能性保健食品。