Carrying Rates and Differences of Fungi Associated with Four Tomicus Species in Yunnan

切梢小蠹的带菌率检测，所需要的实验材料：各种虫态切梢小蠹，包括幼虫、蛹和新成虫，健康木段；解剖镜，MEA培养基，解剖镊，普通镊子，酒精灯，手术剪，脱脂棉，打孔器，刮刀等。切梢小蠹采样地选择蠹害重灾区的弥勒、丘北、陆良等地松林，在切梢小蠹的梢转干期(2014年12月-2015年3月)采集受害松枝梢，采集不同种类切梢小蠹成虫各60头，用于不同虫种成虫带菌率和各器官带菌率实验；同时采集不同切梢小蠹蛀干的蠹害木各3段，每段50 cm，带回实验室获取各虫态的切梢小蠹，用于不同虫态切梢小蠹带菌率实验；取健康木段若干用于带菌率接种。

切梢小蠹各器官带菌判断方法是，根据切梢小蠹伴生菌使正常的寄主植物木质部蓝变的现象^[13]，以此确定各器官是否带菌(如图 1)。从枝梢上采集的切梢小蠹，采样时间于2014年12月-2015年3月，此时切梢小蠹在枝梢补充营养已完成，枝梢上的成虫已准备好转干进行蛀干繁殖。用解剖镜区分种类后，分别取云南切梢小蠹、横坑切梢小蠹、松芽小蠹和华山松切梢小蠹活虫各30头。在未发生切梢小蠹危害的云南松健康林分，伐倒胸径8~10 cm云南松，仔细检查松梢和树干，确认伐倒云南松未受小蠹和其它蛀干害虫危害后(即健康云南松)，将伐倒木截成长50 cm木段，取直径8~10 cm木段若干，用白乳胶和牛皮纸将木段的两端封住，保持木段湿度。用打孔器在木段上打一小孔，孔深到木质部与韧皮部之间，孔径1 cm，每根木段打5个小孔，小孔与小孔间隔5 cm以上，将不同种类的切梢小蠹放入孔内(1头/孔)，然后将原孔塞放回将虫压死并封住孔口；同时选取3组(段)，仅打孔，取孔塞，再放回孔塞，作为对照。将接种后的木段放在25℃的养虫室中，试验木段自然竖立。30天后，刮开接种的部位，观察是否有蓝变，统计蓝变的数量。

Figure 1.  Blue stain of host plant by Tomicus

根据切梢小蠹伴生菌使正常寄主植物木质部变蓝的现象，确定不同虫态切梢小蠹是否带菌。不同虫态的切梢小蠹采集时间于切梢小蠹蛀干期间的12月，具体操作方法是：从野外采集的被不同切梢小蠹蛀干后的木段，将受蠹害的木段，用消毒刮刀刮去树皮留下韧皮部，分别在不同切梢小蠹蛀干的蠹害木中取出不同虫态切梢小蠹，幼虫、蛹、新成虫各30头，如果木段中还未见各种虫态切梢小蠹，将木段放置1~3周，待切梢小蠹在木段产卵并发育成各种虫态。将每种切梢小蠹的虫态分别接种到健康木段，将接种后的木段放在25℃的养虫室中，30天后，刮开接种部位，统计蓝变数量。

从枝梢上采集的切梢小蠹，用解剖镜区分种类后，分别取云南切梢小蠹、横坑切梢小蠹、松芽小蠹和华山松切梢小蠹活虫各30头，用解剖镊和手术剪分别取下成虫的头、足和翅。取新鲜云南松木段将两端封住，保持木段湿度。用打孔器在木段上打一小孔，孔深到木质部与韧皮部之间。将已分开的不同种类的切梢小蠹的头、足和翅放入孔内，然后将孔塞放回并封住孔口，将接种后的木段放在25℃的养虫室中。30天后，刮开接种的部位，观察是否有蓝变，统计蓝变的数量。

2015年2月在云南陆良选择3种蠹害林分：位于小白户镇的切梢小蠹轻度危害云南松林区A(枝梢被害率小于20%)，位于芳华镇的中度危害云南松林区B(枝梢被害率20%~50%)和位于马街镇的重度危害云南松林区C(枝梢被害率大于50%)，在3个林区随机选取50个切梢小蠹蛀食坑道，用解剖镜观测坑道内是否有伴生菌孢子产孢结构或蓝变现象，统计切梢小蠹入侵孔数(包括有效侵入孔和无效侵入孔)，带菌坑道率和有效坑道率，分析切梢小蠹危害程度与切梢小蠹带菌率的关系。

30天后，对照木段组，均未发现蓝变现象。处理组，将4种切梢小蠹成虫接种到新鲜木段，根据木段接种部位蓝变数量统计得出：云南切梢小蠹带菌率最高，达到80 %，横坑切梢小蠹带菌率次之，为63 %，松芽小蠹带菌率为53 %，华山松切梢小蠹带菌率为56 %(见表 1)。

30天后，对照木段组，均未发现蓝变现象。处理组，分别取不同虫态的切梢小蠹，接种到木段中，统计蓝变数量，总供试幼虫的带菌率为90%，其中，云南切梢小蠹幼虫的带菌率最高达到100%，华山松切梢小蠹幼虫的带菌率次之为93%，横坑切梢小蠹和松芽小蠹幼虫的带菌率分别为87%和80%。总供试蛹的带菌率为78%，种间，横坑切梢小蠹蛹的带菌率最高为87%，云南切梢小蠹和松芽小蠹蛹的带菌率均为80%，华山松切梢小蠹蛹的带菌率最低67%。总供试新成虫的带菌率为58%，种间，云南切梢小蠹>松芽小蠹>横坑切梢小蠹=华山松切梢小蠹，新成虫的带菌率分别为67%，60%，53%，53%(表 2)。经数据显著性分析结果表明，4种切梢小蠹不同虫态带菌率种间差异极显著(P < 0.01)，但同一虫态间没有差异(P>0.05)，均表现为：幼虫的带菌率明显高于蛹，而新成虫的带菌率又明显小于蛹的带菌率。

30天后，对照木段组，均未发现蓝变现象。处理组，分别取4种切梢小蠹的头、足和翅，接入木段，统计木段蓝变数量，总供试切梢小蠹成虫的头的带菌率为33 %，种间差异显著(0.01 < P < 0.05)，横坑切梢小蠹的带菌率最高，为40%，华山松切梢小蠹带菌率最低27%，云南切梢小蠹和松芽小蠹带菌率均为33%。总供试切梢小蠹成虫的足的带菌率为30%，种间差异显著(0.01 < P < 0.05)，横坑切梢小蠹>华山松切梢小蠹>云南切梢小蠹>松芽小蠹，带菌率分别为40%，33%，27%，20%。总供试切梢小蠹成虫的翅的带菌率为32%，种间差异显著(0.01 < P < 0.05)，云南切梢小蠹>横坑切梢小蠹>华山松切梢小蠹=松芽小蠹，带菌率分别为40%，33%，27%，27%。(表 3)。经数据显著性分析结果表明，4种切梢小蠹成虫的头、足、翅的带菌率种间存在差异，但总体而言，切梢小蠹成虫的头部带菌率稍高于足和翅的带菌率，但差异并不明显(P>0.05)。由此见，切梢小蠹伴生菌在切梢小蠹虫体上分布较为均匀，未集中于虫体某一部位。

基于蠹害轻、中、重3个林区的调查发现，由表 4、表 5分析可知，在云南陆良县，横坑切梢小蠹在云南松上的危害发生数量高于云南切梢小蠹。横坑切梢小蠹的带菌率存在一定的随机性，轻度林区为50%，中度林区为39.29%，重度林区为66.67%(表 4)。云南切梢小蠹的带菌率与林分的蠹害程度同样存在一定的随机性，轻度林区为68.18%，中度林区为86.36，重度林区为23.53%(表 5)。但分析蛀害的成功率(有效坑道率)发现，不管是云南切梢小蠹还是横坑切梢小蠹，检测出带伴生菌(Ophiostoma canum)的切梢小蠹的坑道，其蛀害成功率(有效坑道率)均显著的高于未检测出伴生菌的切梢小蠹的蛀害成功率，而且云南切梢小蠹和横坑切梢小蠹带菌组在轻、中、重3种蠹害林区有效坑道率均大于无菌组，由此表明，伴生菌的存在显著提高了切梢小蠹的蛀干繁殖成功率，进而加速了松树的死亡进程(表 4，表 5)。

小蠹虫伴生菌被认为是小蠹虫形成严重灾害的重要原因，然而由于小蠹与其伴生菌的共生关系，给专门的伴生菌研究带来了一定的困难。在本试验过程中，我们将虫体直接放入培养皿中，看是否能长出伴生菌的菌落，以此来检测带菌率，实验发现，由于小蠹虫的体表携带了大量的细菌和其他真菌等微生物，因此这种方法比较难检测到并分离伴生菌。本项研究根据伴生菌的侵入特点，病原真菌通过小蠹虫的蛀害过程被携带进入寄主树木组织内，病原真菌在寄主树木组织内生长使韧皮组织坏死，并在韧皮上形成一个棕褐色的韧皮反映区，同时在树体内大量繁殖，并在木质部横截面上表现出蓝色菌斑、松脂斑和失水斑症状，从而使组织丧失正常的物质运输功能，最终导致寄主树木枯萎，甚至干枯死亡^[9-12]。利用切梢小蠹伴生菌侵入寄主后会使木质部蓝变的现象，采用间接接种到木段的方式，将不同虫态切梢小蠹，以及成虫的头、足、翅3个重要器官部件，分别接入木段中，一段时间后，通过检测木质部是否蓝变，判断切梢小蠹带菌情况，通过统计蓝变数量，计算切梢小蠹试验材料的带菌率，从而判断试验材料是否带菌，取得了较好的试验检测效果。

采用上述方法，本研究首次分析比较了在云南分布的4种切削小蠹成虫伴生菌带菌率的差异，结果表明，云南切梢小蠹成虫带菌率明显高于其它3种小蠹成虫的带菌率，这也印证了多年以来云南切梢小蠹在云南严重危害，其危害程度明显高于横坑切梢小蠹等其它3种小蠹的事实。已有研究证实，云南切梢小蠹对云南松的攻击力(蛀干能力)显著的高于横坑切梢小蠹^[19-24]，基于本研究结果，云南切梢小蠹的带菌率明显高于其它3种切梢小蠹，在云南的云南切梢小蠹的危害程度明显高于其它3种小蠹，这其中与小蠹虫带菌率的高低存在一定的关系。本项试验结果表明，切梢小蠹不同发育阶段，幼虫的带菌率最高，其次是蛹的带菌率，新成虫的带菌率最低，其中，云南切梢小蠹幼虫的带菌率高达100%。分析认为，幼虫在寄主树皮下韧皮内生活，即在伴生菌最适生长区域内生长，极容易携带伴生菌，这可能是切梢小蠹幼虫的带菌率相对较高的主要原因；此外，伴生菌的菌丝或孢子很可能是切梢小蠹幼虫的食物之一^[8-9]，或是参与了幼虫对木质素的消化和分解^[8-9]，便于幼虫的取食，这也是幼虫带菌明显高于其它虫态的原因。对蛹来说，幼虫逐渐蜕皮变蛹，伴生菌会随表皮的蜕去而使蛹的带菌率降低；新成虫带菌率再次降低，可能也以新成虫从蛹壳中羽化蜕壳，蜕去携带大量伴生菌的蛹壳，使新成虫带菌率又随之下降。因此造成了切梢小蠹不同发育阶段带菌率的差异。

国外研究发现，有的小蠹虫，如材小蠹科Scolytidae，有专门携带伴生菌的贮菌器(mycangia)，贮菌器是与小蠹虫分泌细胞相联系的角质层结构，因其所在位置不同分为胸贮菌器、颚贮菌器、上颌骨贮菌器和外部凹陷贮菌器等^[8-9]。根据小蠹虫是否有贮菌器，还可以把伴生菌分为由贮菌器携带的伴生菌和不由贮菌器携带的伴生菌，贮菌器可以帮助小蠹虫携带伴生真菌的孢子和菌丝，还有助于小蠹虫的化学通讯，有贮菌器的小蠹虫依靠贮菌器携带伴生菌，而不具有贮菌器的小蠹虫是通过小蠹虫体表携带伴生菌^[7-10]。通过本项研究，切梢小蠹头、足和翅3个重要器官带菌率近似，差异不明显，揭示了切梢小蠹伴生菌在切梢小蠹体表均匀带菌的结果，对于切梢小蠹体内是否有贮菌器的生理结构，伴生菌又是否为由贮菌器携带的伴生菌，还有待深入研究。

通过野外调查，揭示了切梢小蠹危害程度与切梢小蠹带菌率的关系。从调查分析结果来看(表 4，表 5)，表观上，切梢小蠹的带菌率与林分的蠹害程度存在一定的随机性，轻度危害的蠹害林分，小蠹在树干内的带菌率高达68%，而即使是重度危害的蠹害林分，小蠹在树干内的带菌率也仅有23.5%。但研究发现一个普遍的现象，即只要切梢小蠹携带了伴生菌，其蛀干繁殖的成功率一定高于不携带伴生菌的切梢小蠹的蛀干繁殖的成功率，即具体到每一株受害松树，伴生菌的存在能使切梢小蠹快速形成其有效的繁殖坑道，导致受害松树的营养供给被切断，也就加速了受害木的死亡进程。如表 5所示，陆良县蠹害重度发生林分，在随机调查的17个云南切梢小蠹的坑道中，有4个坑道检测出伴生菌O. canum，其它的13个坑道未检测出，云南切梢小蠹带菌率仅有23.5%，进一步解析木段坑道发现，携带了O. canum的坑道，有3个坑道为有效侵入坑道(坑道完整，有交配室、母坑道、子坑道等)，仅有1个无效侵入坑道(仅有侵入孔，未形成有交配室、母坑道、子坑道等)，有效坑道率为75%；而相对应的13个无伴生菌坑道，仅有3个坑道成功发展为有效侵入坑道，有效坑道率仅为23%。因此，基于本次野外调查结果，可以看出，切梢小蠹伴生菌在小蠹成功蛀干繁殖的过程中扮演着重要的正向作用，在有伴生菌的参与情况下，切梢小蠹的蛀干成功率均明显高于无伴生菌小蠹虫的蛀干成功率，伴生菌的存在加速了受害松树的死亡进程。

本研究首次分析比较了中国云南分布的4种切削小蠹成虫伴生菌带菌率的差异。在中国云南，云南切梢小蠹成虫伴生菌的带菌率为80%，明显高于横坑切梢小蠹、松芽小蠹、华山松切梢小蠹等3种切梢小蠹成虫的带菌率，3者的带菌率值分别为63%、53%、56%。切梢小蠹不同虫态伴生菌的带菌率种间存在差异，其中，云南切梢小蠹幼虫的带菌率高达100%，明显高于横坑切梢小蠹、松芽小蠹、华山松切梢小蠹3种切梢小蠹幼虫的带菌率。虫态间，切梢小蠹幼虫的带菌率明显高于蛹和新成虫，3者的带菌率分别为90%、78%、58%。切梢小蠹成虫的头、足和翅不同部位伴生菌的带菌率差异不明显，未发现切梢小蠹特异的带菌器官，头、足、翅的带菌率分别为33%、30%、32%。野外调查表明，切梢小蠹伴生菌在小蠹成功蛀干繁殖的过程中扮演着重要的正向作用，在有伴生菌的参与情况下，切梢小蠹的蛀干成功率均明显高于无伴生菌小蠹虫的蛀干成功率，伴生菌的存在加速了受害松树的死亡进程。研究结果为揭示切梢小蠹成灾机制及探索切梢小蠹有效防控新途径提供了科学数据支持。