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枣缩果病也称为枣黑斑病[1]、枣铁皮病、枣干腰缩果病[2]和枣褐腐病[3]等,发病的枣果瘦小,在成熟前极易脱落[4],没有商品价值。该病在全国各大枣区都有发生,是目前枣树生产中最严重的果实病害之一。枣缩果病菌可在花期侵入[5-6],也可以在幼果期从果洼处侵入,侵入后的病菌呈潜伏状态,直至8月中下旬才开始发病[7],但是,至发病前,枣果在林间没有任何病症。至今对该病害的初侵染来源尚不清楚。
研究发现,互隔链格孢菌(Alternaria alternata)是枣缩果病的初侵染病原菌[8-9]。该菌是一种常见的真菌,对基质和生态环境有着极强的适应性[10]。目前,在全世界的链格孢种级分类单位中,95%以上的链格孢种类兼性寄生于植物上。据报道,互隔链格孢菌危害番茄的果实,引起番茄黑斑病[11-12];危害烟草,引起烟草赤星病[13-14];苹果链格孢菌(A. mali)是苹果褐纹病的病原菌,主要危害嫩叶,也危害果实和枝条[15-16];互隔链格孢菌还可以引起梨黑斑病[17-18]和杨树叶枯病[19]。在我国北方,枣园附近一般有农户居住,周围常种植果树和蔬菜等植物,且道路旁边大多以杨树作为行道树。枣缩果病初侵染互隔链格孢菌除侵染枣属植物外,是否能侵染危害非枣属植物尚未见报道。
本研究将供试材料以刺伤和无伤接种的方式,接种经绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的枣缩果病菌CN193::gfp菌株,采用组织分离法[20]对供试材料病原菌进行分离,并以荧光显微镜观察,以探究枣缩果病菌侵染非枣属植物的情况,了解其寄主范围及初侵染来源,防止多种植物间相同病菌交互侵染而加重病害的发生,为生产上正确指导枣树周围植物合理布局提供参考。
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番茄刺伤接种的果实(图 1A)与无伤接种的果实(图 1B)表面均出现褐色或黑色的病斑,形状为圆形至不规则,中间略微凹陷;病斑表面出现绒毛状的菌丝和分生孢子,在果实发病的后期,有时多个小病斑结合成大病斑,感病果实逐渐软腐。刺伤接种对照(图 1a)和无伤接种对照(图 1b)均没有异常变化。
烟草刺伤叶片并未出现烟草赤星病所具有的典型症状,只是在刺伤处出现了结痂状结构,表面变硬,逐渐失水干枯变黄,由伤口中部向四周逐渐剥落。
苹果果实感病后,表面出现褐色斑点(图 1C),且斑点周围带有红色晕圈;对照(图 1c)的伤口处只有轻度褐变。苹果叶片受害后,初期表面出现褐色圆形的小斑点,且周围带有紫褐色的晕圈,在适宜的条件下,多个小病斑结合在一起形成不规则的大病斑,叶片到最后开始枯焦脱落(图 1D)。果实和叶片(图 1d)的对照均没有异常变化。
梨果实接种后,表面出现黑色、略凹陷的圆形病斑,稍有同心的轮纹,且病斑表面有菌丝和黑色的霉层(图 1E),后期果实逐渐软腐;对照(图 1e)的果实伤口只有轻微褐化,没有发病症状。梨叶片接种后,表面略微显现出带有轮纹的淡黑褐色病斑(图 1F),后期病斑直径可达20 mm;对照(图 1f)的叶片只有刺伤口有轻微褐变。
毛白杨叶片(图 1G)与加杨叶片(图 1H)感病初期,因失绿形成圆形、多角形至不规则形状的褐色病斑,且病斑逐渐扩大;感病后期,病斑出现黑褐色霉状物,若干小病斑相互连接形成大病斑,导致叶片枯死脱落;对照(图 1g和图 1h)没有异常变化。
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由图 2可知,接种孢子悬浮液的离体果实和叶片培养3 d后,除烟草外,刺伤的材料均发病,经方差分析,各材料的发病率差异不显著(P>0.05);培养5 d后,苹果果实的发病率增幅最大,番茄发病率增幅最小,经方差分析,番茄和苹果果实之间发病率差异显著(P<0.05),其他各材料在第5 d的发病率差异不显著(P>0.05);培养7 d后,各材料的发病率都较高,且差异不显著(P>0.05)。无伤接种的各材料中,只有番茄发病,5 d后发病率为8.3%,7 d后发病率为12.5%,其他各材料和对照组的材料均未发病。
Figure 2. The incidences of fruits and detached leaves from different potential host plants inoculated with spore suspension of Alternaria alternata CN193::gfp at different dates
离体枝条上的叶片刺伤接种孢子悬浮液后均发病,比较培养3 d后的发病率,苹果的相对较低,梨的相对较高,二者的发病率有显著性差异(P < 0.05),其他材料之间发病率差异性不显著(P>0.05);比较培养5 d后的发病率,苹果的相对较低,毛白杨的相对较高,苹果的发病率与其他材料之间有显著性差异(P < 0.05)。各材料的发病率见表 1。
% 培养时间
Incubation time离体枝条叶片(刺伤)
Leaves on a detached branch (stab wound)苹果
M.domestica梨
P.bretschneideri毛白杨
P.tomentosa加杨
P.canadensis3 d 10.4±3.9 b 31.3±4.3 a 20.8±5.4 ab 25.0±4.8 ab 5 d 41.7±5.6 b 58.3±6.2 a 66.7±5.6 a 62.5±3.7 a 注:表中数据为平均数±标准误。同行不同小写字母表示LSD法检验在P<0.05水平差异显著。
Note: Data are mean±SE. Different letters in the same row indicate significant difference at P<0.05 level by LSD test.Table 1. The incidences of leaves from detached branches of different host plants at different dates after inoculation with spore suspension of Alternaria alternata CN193::gfp
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番茄果实(图 3A)感病部位组织用荧光显微镜可看见含有荧光的菌丝,而对照(图 3B)除果肉中自带的微弱荧光外,则观察不到菌丝的荧光;而在苹果果实和叶片、梨果实和叶片、毛白杨和加杨叶片感病部位组织中,由于受组织内叶绿体的影响,在荧光显微镜下无法观察到含有荧光的菌丝。
Figure 3. Observation of the tomato fruit tissues with and without infection under fluorescence microscope
如图 4,对番茄、苹果果实和叶片、梨果实和叶片、毛白杨和加杨叶片发病部位的组织进行分离,所有发病材料在加有10 μg·mL-1潮霉素B的培养基上均长出菌丝;分别挑取菌丝用荧光显微镜观察,菌丝中都有荧光,且荧光强烈,在40×10显微镜下可清晰地看到菌丝中带有荧光的质粒,表明互隔链格孢菌CN193::gfp菌株是导致发病的病原菌。