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新疆野苹果(Malus sieversii (Ledeb.) Roem.)又称塞威氏苹果，属第三纪孑遗植物，可能是现代栽培苹果的祖先种。我国新疆野苹果是研究世界苹果遗传多样性和基因进化的重要天然基因库，对我国优质栽培苹果的生产具有重要作用。新疆野苹果主要分布于我国新疆伊犁州的巩留县、新源县、霍城县，塔城地区的额敏县、裕民县、托里县等地[1]。其果实形态、颜色、风味等变异很多，并且在长期的自然进化过程中形成了许多具有抗寒、抗病虫害等优良性状的新疆野苹果种群或单株[2-3]。近年来新疆野苹果的生存状态受到人类活动、苹小吉丁和苹果腐烂病等因素影响较为严重[1, 4]。受苹小吉丁危害枯死的新疆野苹果枝干上分布着大量苹果腐烂病菌，自然条件下，苹果小吉丁虫往往和苹果腐烂病等混合发生，复合危害新疆野苹果林的生存状态[4]。自然条件下植物的健康状况往往不是受单一因素的影响，而是受病害、虫害、生境、植物自身特征等多种因素综合影响[5]。目前关于我国新疆野苹果枯死原因尚不清楚。因此，可以通过不同枯枝症状新疆野苹果遗传特征的比较，寻找与枯死症状相关的遗传特征，推测引起差异症状的原因及可能的胁迫因子。
水杨酸是植物体内一种小分子酚类物质，参与活体营养型病原菌引发的防御反应，并诱发植物的系统获得抗性[6-7]。Pasqualini等发现臭氧可诱导烟草叶片中水杨酸含量的升高，高浓度的水杨酸可增加烟草植株中活性氧含量从而激活植株细胞死亡等植物防御机制[8]。水杨酸不仅可以通过抑制病原菌分泌的细胞壁降解酶的活性降低病原菌的致病力，还能作为信号诱导植物体内病程相关基因的表达，增加植物抗病能力[6, 9]。在苹果属植物与其病原菌互作过程中，水杨酸作为信号物质而起到重要的作用[9-10]。不同抗枣疯病性枣树间水杨酸含量差异极其显著(P < 0.01)，并且水杨酸的组成和含量与枣树抗枣疯病性呈现一定的相关性[12]。植物的组成抗性是植物在未受到侵害时就已经具备的天然抗性屏障，防御蛋白是组成抗性的重要组成部分，已有研究表明植物防御蛋白与植物胸径(diameter at breast height, DBH)关系密切[13]。张睿彬等研究发现胸径大的东北红豆杉针叶内苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)的活性显著高于胸径小的(P < 0.05)[13]。此外，植物胸径的大小与植物树龄、立地条件、气候环境等具有一定程度的相关性。
新疆野苹果树大面积衰败和死亡，遗传资源面临严重威胁，但是新疆野苹果林的生态退化机理目前尚不清楚。在巩留的野外调查发现：同一采样点、同一生境条件下不同新疆野苹果种群或单株表现出不同的抗逆性，有的新疆野苹果株系健康，枝叶繁茂；有的新疆野苹果株系受病原菌或其它胁迫因子影响枯枝严重甚至枯死。而关于同一生境下，不同新疆野苹果株系表现出不同症状的原因尚未见报道。因此，有必要寻求新的研究思路揭示野苹果抗病原因。关于我国新疆野苹果化学成分、遗传多样性等方面的研究相对较多[1]，但这些因素与新疆野苹果抗病虫害关系尚未见报道。因此，本研究对同一生境、同一采样地表现出不同枯枝症状的新疆野苹果中水杨酸组成和含量差异进行分析；并将不同枯枝症状级别新疆野苹果的水杨酸含量与胸径结合分析，寻找与新疆野苹果枯枝症状相关的遗传特征，为天山野果林的保育和优质苹果资源的选择提供参考。
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2016年7月至9月，对新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州巩留县阿勒玛勒山同一生境条件下的123株新疆野苹果病虫害、生境等状况进行调查，测定、记录胸径和采样地点海拔、经纬度等信息，调查点经纬度为82°49′23.26″E、43°15′17.06″N，海拔高度为1 188m。根据调查点新疆野苹果树上的枯枝率(一株新疆野苹果树上的枯枝量占总枝量的比率)，对新疆野苹果枯枝症状按级别进行划分[5]，共分6个级别：0级(0)、Ⅰ级(0~10%)、Ⅱ级(10%~40%)、Ⅲ级(40%~60%)、Ⅳ级(60%~90%)、Ⅴ级(90%~100%)。其中，以0级(0)为对照。新疆野苹果不同级别的枯枝症状如图 1所示。
Figure 1. Deadwood symptom of Malus sieversii with different grades
每个级别选取胸径、长势相似的4株新疆野苹果取样用于植物化学分析。每株树单独采取树中部枝叶若干，枝叶样品干燥粉碎后称取2.0 g备用。
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甲醇为色谱醇，水为超纯水，由MILLI-Q超纯水纯化系统制得。水杨酸标准品为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，含量[C7H6O3]≥99.5%。其他试剂均为分析纯。
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KQ-600E型超声波清洗仪(昆山市超声试仪器有限公司), RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，Ohaus电子分析天平(上海奥豪斯公司)，DL-101-3 BS型电热鼓风干燥箱(天津市中环实验电炉有限公司)，FW100高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，ZDP-2270型全自动新型电热培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)，美国安捷伦1200高效液相色谱系统，包括G1322A型脱气机，G1312A型二元泵，G1329A-ALS型自动进样器，G1316A-TCC型柱温箱和G1365D-MWD型紫外检测器。
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新疆野苹果枝叶样品40℃烘干粉碎，精确称取样品粉末2.0 g，置入100 mL锥形瓶中，加入30 mL甲醇超声处理1 h，取上清液过滤。残渣按上述方法再处理1次。合并两次上清滤液，用旋转蒸发仪将上清液40℃减压蒸干。用10 mL甲醇洗脱圆底烧瓶底部浸膏，野苹果样品提取液-20℃保存备用。
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新疆野苹果样品提取液经0.22 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析，样品检测的色谱条件为：色谱柱热电ODS(4.6 mm×200 mm, 5 μm)；流动相为60%甲醇和40%水(体积比)，pH值约为3；柱温为室温；检测波长为220 nm；流速为0.8 mL·min-1；通过外标法对检测成分定性定量。每份样品做3个平行检测。新疆野苹果枝叶样品中水杨酸含量以平均值±标准差的形式表示，单位为mg·kg-1。
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本研究数据的单因素方差分析、多重比较和相关性分析等采用SPSS 13.0统计软件完成，显著性水平P=0.05。图采用Sigma Plot 12.0绘图软件完成。
1.1. 实验材料
1.1.1. 新疆野苹果调查采样和枯枝症状级别划分
1.1.2. 试剂
1.1.3. 实验仪器
1.2. 实验方法
1.2.1. 水杨酸提取
1.2.2. HPLC检测
1.3. 数据处理
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对不同症状级别新疆野苹果枝叶中的水杨酸含量检测表明：水杨酸含量在Ⅴ级样品水杨酸含量最高，为122.6 mg·kg-1；0级样品水杨酸含量次之，为111.7 mg·kg-1；Ⅱ级样品中水杨酸含量最低，为39.5 mg·kg-1；Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ级样品中水杨酸含量基本一致，分别为81.8、90.3、98.5 mg·kg-1(图 2)。单因素方差分析和LSD、Duncan分析表明新疆野苹果不同症状级别间水杨酸含量差异显著(P=0.01 < 0.05)。新疆野苹果部分症状级别两两之间也有显著差异(P < 0.05)，Ⅱ级样品水杨酸含量与0、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级样品水杨酸含量差异显著(P < 0.05)，与Ⅰ级样品中水杨酸含量差异并不显著(P>0.05)(图 2)。由图 2可知，新疆野苹果枯枝症状从0级到Ⅴ级，水杨酸含量存在一个先降低后升高的变化趋势。
Figure 2. Salicylic acid contents and their differences in different symptom grades Malus sieversii
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对不同枯枝症状级别新疆野苹果水杨酸含量进行相关性分析发现：0级与Ⅰ级、0级与Ⅴ级、Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅰ级与Ⅳ级、Ⅰ级与Ⅴ级、Ⅱ级与Ⅳ级、Ⅳ级与Ⅴ级样品之间水杨酸含量存在一定程度的正相关性；0级与Ⅱ级、0级与Ⅲ级、0级Ⅳ级、Ⅰ级与Ⅲ级、Ⅱ级与Ⅲ级、Ⅱ级与Ⅴ级、Ⅲ级与Ⅳ级、Ⅲ级与Ⅴ级之间样品之间水杨酸含量存在一定程度的负相关性，但相关性水平均不显著，如表 1所示。Ⅲ级样品与所有级别样品之间的水杨酸含量均呈负相关，相关性不显著。由此可知，不同枯枝症状级别的新疆野苹果中水杨酸含量存在一定的相关性，但相关性水平均不显著(P>0.05)。
症状级别
Symptom grade参数
Param.0级 Ⅰ级 Ⅱ级 Ⅲ级 Ⅳ级 Ⅰ级 r 0.163 P 0.837 Ⅱ级 r -0.817 0.301 P 0.183 0.699 Ⅲ级 r -0.275 -0.119 -0.165 P 0.725 0.881 0.835 Ⅳ级 r -0.061 0.440 0.580 -0.869 P 0.939 0.560 0.420 0.131 Ⅴ级 r 0.749 0.770 -0.357 -0.166 0.171 P 0.251 0.230 0.643 0.834 0.829 Table 1. Correlation analysis of salicylic acid content in different symptom grade Malus sieversii
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对巩留同一立地条件下123株新疆野苹果胸径测量、统计表明：新疆野苹果枯枝症状为Ⅱ级的样品胸径平均值最大，为38.38 cm；枯枝症状为Ⅴ级的样品胸径平均值最小，为31.16 cm。单因素方差分析表明：不同枯枝症状级别的新疆野苹果胸径大小差异并不显著(P>0.05)。LSD、Duncan分析表明：新疆野苹果不同枯枝症状级别组间也没明显差异(P>0.05)，如表 2所示。由此推知新疆野苹果枯枝症状级别与其胸径大小关系并不明显。不同枯枝症状级别新疆野苹果胸径大小的变异系数差异明显，变异系数由大到小依次为：Ⅴ级>0级>Ⅱ级>Ⅳ级>Ⅲ级>Ⅰ级。Ⅴ级样品个体间胸径大小的变异系数最大，为39.18%；Ⅰ级样品个体间胸径大小的变异系数最小，为30.28%；Ⅲ、Ⅳ级样品个体间胸径大小的变异系数基本一致，分别为31.05%和31.22%(表 2)。
症状级别
Symptom grade调查数量/株
Survey No.平均值
Mean/cm最大值
Max/cm最小值
Min/cm标准差
St Dev/cm变异系数
Coefficient of Variation/%0 21 33.05 65.00 20.00 12.20 36.90 Ⅰ 22 35.00 55.00 15.00 10.60 30.28 Ⅱ 21 38.38 64.00 20.00 13.85 36.08 Ⅲ 21 31.33 60.00 19.00 9.73 31.05 Ⅳ 19 32.58 52.00 14.00 10.17 31.22 Ⅴ 19 31.16 60.00 18.00 12.21 39.18 Table 2. Statistics analysis of DBH sizes of Malus sieversii with different symptom grades
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枯枝症状为Ⅴ级的新疆野苹果样品水杨酸含量最高，胸径变异系数也最大，0级样品的水杨酸含量和胸径变异系数均次之，Ⅰ级样品的水杨酸含量和胸径变异系数均较小，Ⅱ级新疆野苹果水杨酸含量最低，但胸径大小变异系数相对较大，如表 2所示。不同枯枝症状级别新疆野苹果水杨酸含量和胸径大小的相关性分析表明：不同枯枝症状级别新疆野苹果水杨酸含量和胸径大小存在一定程度的负相关性(r=-0.157)，但相关性水平不显著(P>0.05)，如表 3所示。此外，相关性分析表明：0级、Ⅴ级新疆野苹果水杨酸含量和胸径大小呈一定程度的正相关性，相关系数分别为0.162和0.906 (P>0.05)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级样品水杨酸含量和胸径大小呈一定程度的负相关性，相关系数分别为-0.879、-0.217、-0.805和0.551 (P>0.05) (表 3)。由此可知，总体水平上新疆野苹果水杨酸含量和胸径大小存在一定程度的负相关性，不同症状级别新疆野苹果水杨酸含量与胸径大小相关性有所不同，但相关性均不显著(P>0.05)。
参数
Param.0级 Ⅰ级 Ⅱ级 Ⅲ级 Ⅳ级 Ⅴ级 总体
Overallr 0.162 -0.879 -0.217 -0.805 -0.551 0.906 -0.157 P 0.838 0.121 0.783 0.195 0.449 0.094 0.464 Table 3. Correlation analysis between salicylic acid content and DBH of Malus sieversii with different deadwood symptom grades(n=24)
2.1. 不同枯枝症状级别新疆野苹果水杨酸含量及其差异
2.2. 不同枯枝症状级别新疆野苹果水杨酸含量相关性分析
2.3. 新疆野苹果枯枝症状级别与胸径关系分析
2.4. 不同枯枝症状级别新疆野苹果枝叶中水杨酸含量与胸径相关性分析
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水杨酸能诱发植物的抗逆反应，增强其免疫能力[6, 14]。已有研究表明水杨酸可诱导桉树苗显著地增强对青枯病的抗性[15]，应用水杨酸溶液喷洒油茶叶片可有效诱导植株产生对炭疽病的局部或系统性抗性[16]。黎淑芬等研究表明水杨酸可诱导4月生黑松苗产生对松材线虫病不同程度的抗性[17]。此外，水杨酸可增强植物对盐碱、干旱等逆境的抗性[7, 18-19]。本研究结果表明新疆野苹果不同个体、不同枯枝症状级别的水杨酸含量差异显著(P < 0.05)。新疆野苹果枯枝症状从0级到Ⅴ级，水杨酸含量存在先升后降趋势。水杨酸是植物体内重要的信号传导分子，在植物防御病原菌侵染过程中起着重要作用[6, 20-21]。植物受病原菌侵染初期，会发生一系列植物防御反应的早期信号事件，放大信号。这一过程中，植物体内活性氧迸发，水杨酸与水杨酸结合蛋白高度专化结合，诱发脂质过氧化产生小分子脂质物，这些物质可直接诱发基因表达或蛋白质磷酸化；植物体内的NO可以激活水杨酸信号途径并且至少可以部分通过水杨酸信号途径介导真菌诱导子诱发的病原相关蛋白合成积累[22-23]。推测植物受病原菌侵染前期是一个消耗植物体内水杨酸的过程。而植物体内活性氧迸发产生的NO也可促进水杨酸积累[24]；病原菌侵染能激活次生代谢苯现烷类莽草酸途径和异分枝酸途径合成水杨酸导致水杨酸合成增加[22-23]。推测植物受到病原菌侵染一定时期内水杨酸含量水平会显著升高。因此推测随着新疆野苹果病情的发展，在病情发展的不同阶段植物体内水杨酸含量先降后升的趋势可能与水杨酸在植物抗逆性中的效应有关。
此外，新疆野苹果水杨酸含量差异显著也可能与新疆野苹果不同个体间本身存在的遗传特性差异有关。由于植物自身的遗传特性差异，在受到外界胁迫因子的影响时，不同个体会产生不同程度的防御反应从而表现出不同症状[6-7, 14]。已有研究表明在枣树抵御其病原菌植原体的侵染过程中，不同遗传品质、不同抗枣疯病的枣树会通过不同程度的信号转导、基因调控、抗病物质合成等代谢活动来增强枣树植株的抗病能力，从而在受植原体浸染时，不同枣树种质资源会表现出不同的症状反应[25-26]。本研究方差分析表明不同枯枝症状级别的新疆野苹果枝叶间水杨酸含量差异显著(P < 0.05)。由此推测，水杨酸含量的差异可能与类群本身的遗传背景有关。
已有研究表明植物体内参与防御反应的活性物质与植物胸径大小关系密切(P < 0.05)[13]。本研究表明：新疆野苹果不同枯枝症状级别间胸径差异并不显著，其枯枝症状与胸径大小关系并不明显。由此推知新疆野苹果的枯枝率与其自身树龄并不存在显著的关系，但不同枯枝症状级别新疆野苹果胸径大小的变异系数差异明显。新疆野苹果水杨酸含量和胸径大小存在一定程度的负相关性，枯枝率在0~90%之间的新疆野苹果样品水杨酸含量和胸径大小也呈负相关性，但枯枝率为0或>90%的新疆野苹果样品中水杨酸含量与胸径大小却呈正相关性，相关程度并不显著。新疆野苹果枯枝症状级别、水杨酸含量、胸径大小等彼此之间均存在一定的相关性，关系较为密切。不同枯枝症状级别的新疆野苹果水杨酸含量差异显著(P < 0.05)，胸径大小差异并不明显(P>0.05)。
关于新疆野苹果种质遗传变异和系统发育研究表明：新疆巩留县、新源县等地的新疆野苹果种群存在丰富的遗传多样性[27-28]，种群内部遗传分化程度较高[1, 29]。同一采样地、同一生境新疆野苹果枯枝症状级别、水杨酸含量的差异可能与新疆野苹果自身的遗传特征差异有关。由研究结果可知，同一采样地、同一生境新疆野苹果表现出不同枯枝症状，而这些症状差异可能与新疆野苹果本身的分子遗传变异有关。通过分子生物学手段可以很好的揭示植物内在分子遗传变异与其外在抗性表型性状间的关系[29-30]。Klabunde等用11对SSR引物对152份具有不同苹果叶斑病抗性的巴西栽培苹果接穗的遗传多样性评估发现不同抗性栽培苹果间存在丰富的遗传多样性，对苹果叶斑病抗病、感病品种间遗传结构差异显著，有120个等位位点是抗病品种独有的[31]。因此，有待于结合分子生物学手段对同一采样地、同一生境不同新疆野苹果个体的遗传背景做进一步分析。
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本研究对同一采样地、同一生境的新疆野苹果不同枯枝症状级别的水杨酸组成和含量差异进行分析，结果表明：新疆野苹果不同枯枝症状级别间水杨酸含量差异显著(P < 0.05)。新疆野苹果枯枝症状级别从0级到Ⅴ级，水杨酸含量存在先降低后升高的趋势。新疆野苹果不同枯枝症状级别间胸径差异并不显著，其枯枝症状与胸径大小关系并不明显。不同枯枝症状级别新疆野苹果胸径变异系数差异较大。新疆野苹果本身遗传特征可能是同一立地条件下、同一胁迫条件下，新疆野苹果表现出不同枯枝症状的原因之一。因此，有必要通过分子生物学方法对新疆野苹果不同个体的分子变异和系统发育做深入研究，以期揭示不同新疆野苹果个体间更多的遗传信息及其分子变异特征。本研究结果对于探究我国新疆野苹果枯死原因和修复天山野果林生态等具有一定的意义。
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