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侧柏(Platycladus orientalis(L.) Franco)是柏科侧柏属常绿乔木，有广泛的生态适应能力，耐旱、耐瘠薄、耐盐碱，是生态环境修复的主要造林树种，广泛分布于我国各地区，是我国特色树种[1]。因其易繁殖、耐修剪、树形美、寿命长，对有害气体吸收能力强，病虫害轻等特点，也是城市绿化的理想树种。侧柏木材用途广，枝叶和种仁可入药，因而，也是经济价值很高的一个树种[2]。在生产实践中，侧柏育苗以播种繁殖为主。由于侧柏种子轻度休眠，常规采取的预处理方法有沙藏催芽、雪藏催芽和清水浸种。为了给侧柏提供更好的发芽条件，避免出现因出苗率低导致补种，本研究探索采用水杨酸(SA)浸种处理来提高种子活力，培育优质壮苗，提高造林成活率，为侧柏高效培育提供理论指导。
水杨酸(SA)又名邻羟基苯甲酸，是植物体内的一种重要的小分子酚类物质[3]。可调节植物生理代谢功能，缓解逆境条件的胁迫，提高植物的抗逆性[4]。张士功等[5]发现，100 mg·L-1 水杨酸可以显著提高小麦(Triticum aestivum L.)的抗逆性，并且植物体内渗透调节物质含量会显著提高，而渗透调节物质含量的提高是植物体抗逆性提高的重要标志；魏清华[6]发现，水杨酸浓度为120 mg·L-1时对提高木槿(Hibiscus syriacus Linn.)叶片内渗透物质含量、降低丙二醛(MDA)含量以及电导率效果最佳。另外，水杨酸还可以调控植物的生长、发育、成熟、衰老等过程[7]，丁聪聪等[8]试验表明, 1.0~20.0 μg·mL-1的水杨酸可促进蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的生长。范晓龙等[9]研究指出，0.1~0.5 mmol·L-1 水杨酸可促进华北落叶松(Larix principis-rupprechtii Mayr)种子的萌发及幼苗抗氧化酶活性。王宝增等[10]研究发现，外源施用0.6 mmol·L-1 水杨酸能提高盐胁迫下沙打旺(Astragalus adsurgens Pall.)幼苗渗透调节物质的含量，增强超氧化物歧化酶(SOD)的活性，降低质膜透性，从而促进沙打旺的生长发育。总之，前人研究证明，在植物生长发育过程中, 施用水杨酸可提高幼苗的抗逆性且促进幼苗生长，只是在不同植物上水杨酸发挥最佳效果的浓度有所差异。文献研究发现，水杨酸浸种对侧柏种子萌发及幼苗生长方面的研究尚未见报道，本文以当年采收的侧柏种子为试验材料，研究不同浓度水杨酸浸种处理对侧柏种子萌发及幼苗生理特性的影响，探索提高种子发芽率和幼苗质量的途径和方法。
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供试侧柏种子于2017年秋采集于山东省枣庄山亭区徐庄林场。根据GB 2772-1999 《林木种子检验规程》[11]，测得种子千粒质量为21.33 g，初始含水率为7.8%。
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采用水选法剔除杂质、空粒和干瘪粒，取得饱满种子，用0.5%高锰酸钾溶液浸种消毒15 min，蒸馏水冲洗干净后进行水杨酸浸种处理。用0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mmol·L-1的水杨酸浸种24 h，以蒸馏水浸种为对照。浸种后用蒸馏水冲洗3次，播入基质为蛭石的发芽盒中，每处理3个重复，每重复100粒种子。在环境温度25℃，每天光照8 h，黑暗16 h，光照强度为1 200 lx的人工气候箱中培养。从置床次日开始每天透气30 min，及时补充水分，并观察和统计发芽种子数，以胚根突破种皮与种子等长为发芽标准，于第28天终止发芽试验，并测定幼苗形态指标和生理生化指标。
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试验结束后测定发芽率、计算发芽指数(GI)和活力指数(VI)，公式如下：
式中：Gt为第t天发芽数，Dt为发芽的天数(t)
式中：SL为幼苗长度(cm)
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每重复随机选取20株侧柏幼苗，使用直尺测定幼苗地上和地下部分，精度0.01 cm。
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每重复随机抽取幼苗10株左右，称取幼苗1.00 g，加入5 mL 50 mmol·L-1 pH值7.8的磷酸盐缓冲液(含1%的聚乙烯吡络烷酮)冰上研磨，用高速冷冻离心机在4℃下以8 000 r·min-1离心20 min，上清液为酶提取液，冷藏保存。取适量酶提取液按比例稀释后用于各抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量的测定。SOD活性采用氮蓝四唑改良法测定；CAT活性采用紫外吸收法测定[12]；MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法测定[13]。
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采用Excel 2013处理试验数据，SPSS 23.0进行相关分析，以单因素方差分析(One-way ANOVA)和最小差异显著法(LSD)在0.05水平上检验各处理间的差异显著性。
2.1. 种子处理
2.2. 指标测定
2.2.1. 发芽率、发芽指数、活力指数测定
2.2.2. 形态指标
2.2.3. 生理生化指标
2.3. 数据分析
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表 1表明：不同浓度水杨酸处理对侧柏种子的发芽指标均有促进作用，但低浓度水杨酸(≤1.0 mmol·L-1)处理的发芽率、发芽指数和活力指数与对照均差异不显著，而高浓度水杨酸(≥1.5 mmol·L-1)显著促进发芽率及提高发芽指数和活力指数(P < 0.05)。从发芽率来看，整体呈现先迅速升高后缓慢降低的趋势，水杨酸浓度为1.5 mmol·L-1时，种子发芽率最高，为96.3%，比对照提高9.3%。2.0、3.0 mmol·L-1处理的发芽率均高于对照，但与对照差异不显著, 表明水杨酸浸种浓度1.5 mmol·L-1可以显著提高侧柏发芽率，但水杨酸继续增大浓度时促进效果不显著。随水杨酸浓度的增大，发芽指数呈逐渐升高的趋势，在1.5、2.0、3.0 mmol·L-1处理下显著高于对照，分别增加23.4%、24.1%、26.5%，但这3个处理间差异不显著。与CK相比，仅1.0 mmol·L-1水杨酸处理的活力指数有所下降，其他浓度水杨酸处理均有所上升，当水杨酸浓度为1.5、2.0、3.0 mmol·L-1时，活力指数分别提高28.4%、35.4%、29.8%，3个处理间差异不显著。综合各个发芽指标认为，水杨酸处理可显著提高种子活力、促进侧柏种子萌发及发芽更整齐，水杨酸浓度1.5~3.0 mmol·L-1对侧柏种子萌发均有促进作用。
水杨酸浓度
Concentration/(mmol·L-1)发芽率
Germination rate/%发芽指数
Germination index活力指数
Vitality index0.0 87.0±7.00 b 8.77±0.56 c 110.90±17.74 b 0.5 89.7±4.93 ab 9.80±0.40 bc 121.38±14.14 b 1.0 94.3±2.08 ab 9.88±0.24 abc 104.80±2.12 b 1.5 96.3±1.53 a 10.82±0.47 ab 142.40±12.38 a 2.0 95.0±2.65 ab 10.88±0.66 ab 150.11±4.54 a 3.0 95.7±0.58 ab 11.09±0.64 a 143.96±2.24 a 注：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，下同。
Note: Data with different lowercase letters in the same column are highly significantly different (P＜0.05). The same below.Table 1. Effect of various concentrations of salicylic acid on seed germination of Platycladus orientalis
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不同浓度的水杨酸处理对幼苗地下部分和地上部分具有不同的作用效果，从图 1可以看出：随着水杨酸浓度的升高，幼苗地下部分整体呈先减少后增加的趋势，具体表现为水杨酸浓度为0.5 mmol·L-1时与对照差异不显著，1.0 mmol·L-1处理的地下部分比对照降低了20.7%，浓度为1.5、2.0、3.0 mmol·L-1时，地下部分显著高于对照，分别是对照的112.9%、120.2%、113.0%。可见，低浓度水杨酸(≤1.0 mmol·L-1)处理抑制幼苗地下部分生长，而高浓度水杨酸(≥1.5 mmol·L-1)显著促进地下部分生长。侧柏幼苗的地上部分整体呈先增加后减少的趋势；低浓度水杨酸(≤1.0 mmol·L-1)处理对地上部分有促进作用，而高浓度(≥1.5 mmol·L-1)有抑制效应。水杨酸浓度为1.0 mmol·L-1时，地上部分长度最大，达2.90 cm，比对照高19.5%；1.5、2.0 mmol·L-1处理与对照差异不显著，3.0 mmol·L-1处理显著低于对照，下降了16.9%。进一步相关性分析，不同浓度水杨酸处理的地下与地上部分在α=0.01水平(双侧)呈显著负相关，相关系数为-0.795。综合可得，低浓度水杨酸(≤1.0 mmol·L-1)处理抑制地下部分生长、促进幼苗地上部分生长，而高浓度水杨酸(≥1.5 mmol·L-1)促进地下部分生长、抑制地上部分生长。
Figure 1. Effect of various concentrations of salicylic acid on the seedling growth of underground and aerial part of Platycladus orientalis
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由图 2可知：经浸种处理后，侧柏幼苗的SOD活性随水杨酸浓度的升高，呈先迅速升高后缓慢降低的趋势，各处理浓度均显著高于对照，但彼此间差异不显著。这与种子发芽率的变化趋势相一致，意味着SOD活性在一定程度上反映了种子活力的高低。各处理与对照相比差异显著，0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mmol·L-1浓度分别比对照提高了52.3%、60.7%、69.0%、65.2%、57.5%(P < 0.05)，其中，1.5 mmol·L-1 水杨酸处理对SOD活性的增加作用最明显，是对照的1.7倍。
Figure 2. Effect of various concentrations of salicylic acid on SOD activity of Platycladus orientalis
由图 3可看出：随着水杨酸浓度的增加，CAT活性总体呈升高的趋势，其中，1.5 mmol·L-1处理值最大，且与对照差异显著，是对照的133.9%；2.0、3.0 mmol·L-1处理的CAT活性均高于对照，分别是对照的110.7%、119.9%，表明1.5~3.0 mmol·L-1水杨酸浸种处理促进侧柏幼苗体内的CAT活性效果较好。
Figure 3. Effect of various concentrations of salicylic acid on CAT activity of Platycladus orientalis
由图 4可知：丙二醛(MDA)含量整体表现为逐渐降低趋势，但各处理与对照间差异不显著，这可能与SOD和CAT活性的显著升高的动态变化有关。
Figure 4. Effect of various concentrations of salicylic acid on MDA content of Platycladus orientalis
进一步相关性分析(表 2)显示：侧柏种子活力指数、发芽指数和发芽率表现为极显著正相关，可见，活力指数能反映出苗速度和出苗整齐度。不同浓度水杨酸处理侧柏幼苗的SOD和CAT活性与发芽率分别在α=0.01和α=0.05水平(双侧)上呈显著正相关，相关系数为0.601、0.550；SOD和CAT活性与发芽指数呈显著或极显著正相关，相关系数分别为0.562(α=0.05)和0.611(α=0.01)。综合结果表明：随着发芽率提高，侧柏幼苗体内的SOD和CAT活性升高，使MDA含量在安全范围内。
发芽率
Germination rate发芽指数
Germination index活力指数
Vitality indexSOD CAT 发芽指数
Germination index0.805** 活力指数Vitality index 0.647** 0.862** SOD 0.601** 0.562* 0.406 CAT 0.550* 0.611** 0.657** 0.346 MDA 0.046 -0.026 0.001 -0.018 -0.048 注：*、**分别表示在0.05水平(双侧)和0.01水平(双侧)上显著相关。
Note: *, ** means that correlation is significant at the 0.05 level(2-tailed), 0.01 level(2-tailed), respectively.Table 2. Correlative analysis of various concentrations of salicylic acid on indexes of Platycladus orientalis
3.1. 水杨酸对侧柏种子萌发的影响
3.2. 水杨酸对侧柏幼苗地下部分和地上部分的影响
3.3. 水杨酸对侧柏幼苗抗氧化酶和MDA含量的影响
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侧柏经水杨酸浸种处理后，种子发芽指标发生明显的变化。各处理浓度发芽率均比对照有所增加，但仅在浓度为1.5 mmol·L-1时产生显著影响，比对照提高了9.3%。发芽指数在3.0 mmol·L-1处理下达最大，说明水杨酸处理可打破侧柏种子的轻度休眠，显著改善种子萌发状况，对幼苗生长发育具有促进作用。水杨酸对侧柏幼苗的地下部分和地上部分的影响不同，以1.0 mmol·L-1为分界点，此处理的地下部分最小而地上部分达最大值，说明低浓度水杨酸促进幼苗地上部分生长，高浓度则促进地下部分生长，这与赵春旭等[14]的研究结果一致。水杨酸促进地下部分生长的原因可能在于其可以提高幼苗硝酸还原酶活性，降低脱落酸水平，同时增加内源细胞分裂素和生长素水平，从而对根系生长产生促进作用[15-16]。
植物体内有一套完整的抗氧化系统来消除体内的活性氧自由基(O2-)[17]，作为酶促防御系统的重要保护酶类，SOD和CAT参与植物的很多生理生化过程，协同作用及时清除体内活性氧和自由基，并防止自由基毒害，保护细胞膜系统，提高植物组织的抗氧化能力和抗性。其活性的高低及改变程度的大小直接反映植物细胞的被伤害程度，因此，可用其确定植物抗逆性的强弱[18]。SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，参与氧代谢，能够催化植物体内O2-发生歧化反应生成O2和H2O2[19]，但H2O2对机体仍是有害物质；CAT是在需氧生物中普遍存在的一种保护性酶，可将H2O2转化为生命活动可利用的H2O[20]。本试验结果表明，侧柏经过1.5~3.0 mmol·L-1水杨酸处理后，幼苗的SOD和CAT都高于对照，可见，水杨酸浸种可提高抗氧化酶的活性，该结果与康国章等[21]和杨柳等[22]的相关研究结果一致，推测可能与水杨酸激活了抗氧化酶共同的转录因子，诱导抗氧化酶的表达有关[23]。Pancheva等[24]研究认为，水杨酸能够积累在植物细胞膜疏水区，通过降低膜脂的过氧化作用，维持膜结构的完整性，从而缓解胁迫造成的膜损伤。对水杨酸处理后的侧柏幼苗的SOD活性、CAT活性和MDA含量与发芽率和发芽指数进行相关分析，发现这2个抗氧化酶活性与发芽率和发芽指数均呈显著正相关，这与常海文等[25]在沙葱(Allium mongolicum Regel)种子上的研究结果一致。由此认为，抗氧化酶活性可作为判断侧柏种子活力的重要指标。
植物在遭受环境胁迫时，其体内自由基聚积，导致膜脂的过氧化[26]。MDA是植物组织活性氧积累诱发的膜质过氧化最重要的产物之一[27]，能够反映生物膜受损程度，其含量高低可以作为判断植物抗逆性强弱的重要指标[28]。本试验中，MDA含量逐渐降低，与SOD和CAT活性逐渐升高相吻合，可能是SOD和CAT协同作用，有效减轻了细胞膜脂的过氧化程度，避免植物因自由基积累造成氧化损伤，维持了细胞膜的完整性和稳定性，这与南丽丽等[18]在苜蓿(Medicago sativa L.)根系上的研究结果一致。同时，本研究结果表明，不同水杨酸浓度处理的MDA含量与对照差异不显著，可能原因是外界无逆境胁迫，对种子膜结构损伤程度小，产生的自由基和活性氧相对含量较少，再加上植物体内的SOD和CAT对活性氧和自由基的及时清理，大大减弱膜脂过氧化效应带来的危害。
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播种前采用水杨酸浸种在生产实践中具有重要意义，既可以提高种子发芽率，还可提升幼苗出苗率及整齐度，有效降低了播后补种成本。综合分析可得，1.5~3.0 mmol·L-1水杨酸处理对促进侧柏种子萌发、发芽迅速整齐，促进幼苗地下部分生长和提高幼苗SOD和CAT活性效果较佳。对水杨酸处理的结果用最小极差法进行显著性差异分析，发现浓度为1.5、2.0、3.0 mmol·L-1的处理效果差异不显著。因此，从高效、环保、安全和成本角度综合考虑，建议在实际育苗生产中采用1.5 mmol·L-1 水杨酸浸种24 h处理侧柏种子，以提高发芽率、幼苗抗性和整体造林效果。
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