Study on the Seed Vigor of Toona sinensis under Specific Storage Conditions

测试所用种子采集于河南省栾川县。根据GB 2772-1999《林木种子检验规程》^[8]，测得初始发芽率为76.3%，初始含水量为9.1%。

为获得不同含水量的种子，将香椿种子置于100%湿度环境下，每日称质量，观测含水量的变化。最终得到5种不同含水量的种子，分别为9.1%、12.2%、14.0%、15.8%和17.8%。将温度设置为10、15、和20℃ 3个水平对不同含水量种子进行贮藏，以5℃、含水量为9.1%的香椿种子作为对照。将各处理的种子分别置入双层聚乙烯自封袋密封保存在对应温度下的培养箱中，为期90 d。每30 d取样1次测定发芽率及各项生理生化指标。

随机选取贮藏处理的种子，用始温45℃清水浸种24 h后，置于蛭石基质上进行发芽试验。发芽条件是25℃，每天光照8 h，设3个重复，每个重复100粒种子。每天记录发芽情况，在试验结束后测定发芽率，计算活力指数。

式中：S为幼苗平均干质量，Gt为在t日的发芽数，Dt为相应的发芽日数。

准确称取各处理种子1.000 g置于小烧杯内，加入50 mL蒸馏水，充分震荡后于25℃条件下静置24 h，摇匀后用DDS-307型电导仪测定浸出液的电导率值。

称取待测种子0.4 g，加入5 mL 50 mmol·L^-1 pH 7.8的磷酸盐缓冲液(含1%的聚乙烯吡络烷酮)冰上研磨，用高速冷冻离心机在4℃下以8 000 r ·min^-1离心20 min，上清液即为酶提取液，定容至6 mL冷藏保存。取适量酶提取液按比例稀释后用于各抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量的测定。过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性的测定方法参照刘子凡主编《种子学实验指南》^[9]；MDA的测定方法参照高俊凤主编的《植物生理学实验指导》^[10]。

采用Excel 2013和SPSS 23.0统计软件对试验数据进行处理及相关分析。

由表 1、2中可以看出：相同温度条件下，随含水量升高，香椿种子发芽率和活力指数整体上呈下降趋势。初始状态下，当种子含水量达到17.8%时，发芽率已开始下降，下降幅度最大达到了29.6%，对应的活力指数下降了64.7%。随着贮藏时间的延长，含水量为9.1%、12.2%的香椿种子其发芽率在10℃和15℃贮藏条件下大多变化不明显，贮藏前后无显著差异，活力指数小幅下降，但在20℃下，12.2%含水量的种子贮藏60 d后发芽率显著下降，该条件已不适合种子长期贮藏。15.8%、17.8%含水量的种子无论在低温或高温条件下，发芽率和活力指数随贮藏时间延长均显著下降。在20℃下，含水量15.8%和17.8%的种子贮藏90 d，已失去发芽能力，活力指数降为零。这一结果表明：温度和含水量是种子贮藏过程中的关键因素，严格控制种子贮藏条件将有利于保持香椿种子的发芽率。表 3的方差分析结果显示：各贮藏温度和种子含水量之间对香椿种子发芽率和活力指数均有极显著影响，种子含水量和贮藏温度的交互效应也达到极显著水平，其交互作用加剧了种子活力的下降。

由表 4可以看出：随贮藏时间增加，5℃/9.1%、10℃/9.1%、15℃/9.1%、15℃/14.0%和20℃/9.1%的香椿种子SOD活性整体上表现为下降趋势，但在90 d时有所回升，其他大部分条件下的种子SOD活性则表现为先升高，在贮藏30 d时达到最高点，之后再下降的变化趋势。

表 5、6表明：CAT活性的变化趋势与POD相似，即在低温和低含水量情况下，保持较高的酶活性，随含水量或温度的升高，这2种抗氧化酶的活性在整体上都表现为下降趋势。随贮藏时间增加，相同贮藏条件下的香椿种子CAT和POD活性整体上有所下降，贮藏90 d后，不同贮藏处理下的香椿种子SOD和CAT活性与CK均存在显著差异。种子SOD活性随其含水量的升高而显著下降，随温度升高其下降幅度也随之增大。这一趋势与种子发芽率和活力指数的变化相一致，这意味着SOD活性的强弱在一定程度上反映了种子活力的高低。与贮藏前相比，各处理的香椿种子经90 d贮藏后，SOD、CAT和POD活性均显著下降。

表 7的方差分析结果显示：各贮藏温度和种子含水量之间对香椿种子SOD、CAT和POD活性均有极显著影响，种子含水量和贮藏温度的交互效应也达到极显著水平，其交互作用加快了抗氧化活性的下降速率。进一步相关性分析显示：贮藏90 d后，香椿种子SOD、CAT和POD活性的变化与发芽率之间在α=0.01水平(双侧)上均呈显著正相关，相关系数分别为0.869、0.877和0.903。

由表 8、9可知：在相同的贮藏条件下，随贮藏时间的增加，丙二醛(MDA)含量与浸出液电导率的变化相一致，整体上表现为升高趋势。在相同温度条件下，浸出液电导率和MDA含量均随种子含水量的增加而增加。经90 d贮藏后，与CK处理相比，只在10℃/9.1%、15℃/9.1% 2个贮藏条件下的香椿种子浸出液电导率和MDA含量无显著差异。与贮藏前相比，经过90 d的贮藏，种子MDA含量均显著增加，20℃/17.8%处理条件下的浸出液电导率和MDA含量增长幅度均最大，分别达到了24.7%和53.7%。

经90 d的贮藏，除10℃/9.1%和15℃/9.1%2个处理外，其他贮藏条件下的浸出液电导率与CK处理相比均差异显著，其中，20℃/17.8%处理的种子浸出液电导率达到了CK处理的1.98倍。由表 9可以看出：除10℃/9.1%和15℃/9.1%2个处理外，其他各不同贮藏条件下的MDA含量与CK处理相比均显著增大。表 10的方差分析结果表明：各贮藏温度和种子含水量之间对香椿种子电导率和MDA含量均有极显著影响，种子含水量和贮藏温度的交互效应也达到极显著水平，其交互作用促进了贮藏过程中电导率和MDA含量的增加。相关性分析显示，香椿种子在贮藏90 d后浸出液电导率、MDA含量变化与发芽率之间在α=0.01水平(双侧)上均为显著负相关，相关系数分别为-0.895和-0.924，MDA含量与浸出液电导率之间在α=0.01水平(双侧)上呈显著正相关，相关系数为0.918。

种子的贮藏过程是其自然的老化过程，在此过程中会受到多种自身和外部环境因素的影响，其中，种子含水量和贮藏温度是影响种子寿命的2个关键因子。目前，在水稻、西南桦和紫花苜蓿方面的研究结果表明，种子的老化程度与其含水量呈正相关，种子含水量越高，经贮藏后的种子活力下降越快^[11-13]。将种子保存在低温、低含水量的条件下，能更好地保持种子的发芽率^[14]。在贮藏过程中，含水量对于种子产生的劣变作用远大于温度^[15-18]。本研究发现，仅在经过含水量控制的过程中，种子发芽率和活力指数就显著下降，表明香椿种子可能不耐贮藏，控制好种子含水量和贮藏温度，可保持香椿种子活力，延长种子寿命。当环境温度为10~15℃时，含水量9.1%、12.2%的香椿种子经过90 d的贮藏，发芽率下降不明显，表明低温、低含水量有利于香椿种子活力的保持；当温度升高至20℃时，12.2%含水量条件下的种子发芽率和活力指数迅速下降，这说明种子贮藏的安全含水量随温度的变化而产生相应改变，种子劣变是温度和水分共同作用的结果。将温度控制在10℃，含水量提升到14.0%时，香椿种子发芽率即出现显著下降，因此，12.2%含水量是香椿种子安全贮藏的临界点。在种子入库前，应将种子进行干燥处理，确保其达到安全含水量。本研究中得出的香椿种子安全贮藏条件为：当温度不超过15℃时，含水量应控制在12.2%以下；当温度为15~20℃时，含水量应低于9.1%。

SOD、CAT和POD作为抗氧化酶，在种子老化过程中起到关键作用，对清除细胞内自由基、延缓种子衰老有重要意义。SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它可以把有害的机体代谢产生的超氧自由基转化为H₂O₂；但H₂O₂对机体仍然是有害物质，经体内的CAT和POD的作用，可将H₂O₂转化为生命活动可利用的H₂O。这样，3种抗氧化酶共同协作组成了一个完整的抗氧化链条。林程等^[11]研究发现，SOD、CAT和POD的活性变化与种子活力变化整体一致，种子活力越低，POD、CAT和SOD活性也相对较低，能反映出种子质量的高低。常海文等^[19]对沙葱种子的研究认为，种子萌发率与SOD、CAT活性呈显著正相关。此外，还有大量研究表明^[20-23]，SOD、CAT和POD的含量随种子老化程度的加剧而降低。在本研究中发现，对香椿种子进行90 d贮藏，各贮藏条件下的SOD、CAT和POD活性与贮藏前相比均显著下降，且随种子含水量或温度增加，酶活性下降速率均有所加快。对贮藏90 d后的香椿种子的SOD、CAT和POD活性与发芽率进行相关分析，发现这3个抗氧化酶活性与发芽率呈显著正相关，因此，抗氧化酶活性可作为测定香椿种子活力的重要指标。

种子电导率的变化能够反映种子细胞膜结构的完整性，测定种子电导率可以作为鉴定种子活力的快速方法^[17、24]。白亚利等^[25]探究贮藏时间对种子活力的影响时发现，随着种子的老化，电导率值随之增加，即电导率与种子的活力呈负相关。MDA是植物组织活性氧积累诱发的膜质过氧化最重要的产物之一^[26]，可以表明种子的生物膜受到毒害的程度。有多项研究表明^[27-30]，随种子老化程度的加深，种子MDA含量显著增加。在本研究中，随贮藏时间的增加，种子的MDA含量增加，浸出液电导率增大。根据多重比较和方差分析的结果，在低含水量(9.1%)水平下，种子浸出液电导率和MDA含量与CK相比，差异并不显著，维持在较低水平。随含水量或温度升高，电导率和MDA含量均显著增大。另外，相关分析结果显示，浸出液电导率与种子发芽率呈显著负相关，与MDA含量呈显著正相关。在逆境条件下，细胞内部产生大量自由基，因而抗氧化酶活性也处在较高水平，以减轻自由基对细胞膜的损伤。随着逆境加剧，打破了细胞内部自由基的产生与活性氧的清除之间的动态平衡，内环境的恶化抑制了抗氧化酶分解自由基，导致MDA大量积累，内环境进一步恶化，造成种子活力降低，甚至失去发芽能力。由此可见，膜质过氧化作用是引起香椿种子老化劣变的重要原因之一。

香椿种子浸出液电导率、抗氧化系统酶活性和MDA的变化与种子老化程度密切相关。发芽率和活力指数随种子含水量或贮藏温度升高呈下降趋势，而电导率和MDA含量则呈增加的趋势，种子中SOD、POD和CAT活性均随老化程度的加深呈现逐渐降低趋势，香椿种子劣变是温度和含水量交互作用的结果。贮藏90 d后，香椿种子发芽率和活力指数与SOD、CAT、POD活性呈显著正相关，与浸出液电导率、MDA含量呈显著负相关，抗氧化酶活性可作为测定香椿种子活力的指标，膜质过氧化作用是引起香椿种子老化劣变的一个重要原因。对于短期还不能进入使用环节的种子，必须妥善地进行贮藏，以保持较好的种子活力状况。本研究中得出的香椿种子安全贮藏条件为：当温度不超过15℃时，含水量应控制在12.2%以下；当温度在15~20℃时，含水量应低于9.1%。