Construction Strategy of Core Collection Based on Leaf Phenotypic Traits of Tetracentron sinense

于2016年7月，对每个株系长势健康且没有明显病虫危害、分布在其中下层树冠的多年生带叶枝条，分别采集3~4份带回实验室待测。标本存放于西华师范大学植物学标本室。

借鉴韦艳梅等^[25]、戚继忠的^[26]方法，将水青树叶性状先进行分解(图 2)，结合实际情况，选取10个性状。从每个样本中选取15片成熟且完整的叶片进行测量。首先用直尺测量以下指标：叶长、叶宽、叶柄长等，精确到0.01 cm；再借鉴田青等^[27]测量叶面积的方法，用EPSON PERFECTION V350 PHOTO扫描仪1︰1扫描叶片，接着利用AUTO CAD 2006软件计算其面积及周长，进一步计算其叶全长、叶形指数、叶基尖削指数以及叶先端尖削指数等各个参数值^[27]。

Figure 2.  Leaf character decomposition diagram^[28]

相关指标的测量标准和和计算方法如下：

叶长=ah；叶最长=kl；叶全长=ah+hi；叶柄长=hi；叶宽=de；叶形指数=ah/de；叶基尖削指数=(fj+gj)/2/hj；叶先端尖削指数=(bj+cj)/2/aj。

从每样株中筛选出3片叶片，要求每片叶子均是成熟完整的，找到叶片中脉的中间位置，在其两边分别剪取1个1 cm×1 cm的小方块，运用KOH解离法^[20]解离小方块，直到能分离上下表皮，用镊子撕离上下表皮，表皮上的叶肉细胞用毛笔除去，制作叶表皮临时装片，然后用番红染液染色便于之后的观察。

研究气孔器长度、气孔器宽度、上表皮细胞周长、上表皮细胞面积大小、上表皮细胞弯曲度指数、上表皮细胞密度、气孔器密度这7个叶表皮微形态性状^{[13, 24]}。

用Moticam Pro 285A数码显微成像系统观察表皮装片，对每张装片的3个不同的视野进行拍照，并记录下表皮的气孔器数目和上表皮的细胞数目，从而计算出表皮细胞密度和气孔器密度的值。从每张装片中的每个视野上选择3个气孔器，运用Motic Images Plus2. 0软件测量上表皮细胞的周长和面积、气孔器的长和宽，并计算出上表皮细胞弯曲度指数。

根据测量的数据，算出各个表型性状的均值、方差、标准差，变异系数，极差等；最后得出CR%(极差符合率)、VR%(变异系数变化率)、MD%(均值差异百分率)、VD%(方差差异百分率)、T值等10个参数^[29]。相关数据分析在SPSS 23.0上进行，其他常规数据分析在EXCEL等上进行。

先对161个水青树个体利用主成分分析法分析^[30]，再对其进行聚类。运用SPSS软件对分析后的原始数据进行标准化，以此来消除其量纲和数量级，最后得到无量纲数据，其均值为0、方差为1。根据标准化后的数据，利用欧氏距离和瓦尔德法进行逐步聚类，得到各个体间聚类图。

利用总体取样比例法，设定相应的取样比例。目前，绝大多数研究中用来构建种质资源库的取样比例设定在5%~40%^[31]。但又有大量文献表明，总体样本数量少的，其种质资源的取样比例会相对更大一点^[31]。根据本次的161份实验材料，设定10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%10个取样比例。根据设定的10个取样比例，分别用随机(Random sampling strategy)^[32]、位点优先^[29](Allele preferred sampling strategy)和偏离度取样策略^[33](Deviation sampling)3种取样方法进行取样，以此构建各取样比例的种质资源库。通过对这3种取样策略下构建的种质资源代表性进行检验和比较，筛选出最优种质资源库。

对筛选的核心种质资源库的各表型性状参数值进行t检验^[33]，以验证库中的核心种质是否能够有效的代表原种质；再检测评价核心种质资源库中的各系数，比较其与原种质各系数的符合程度。分别对原种质和核心种质资源库进行主成分分析，查看各主成分的累积贡献率及得分情况，确认其核心种质，并评价该种质遗传多样性的高低及其结构的保存水平。

利用软件SPSS计算构建的161个种质的水青树表型性状各指标值见表 1。各表型性状在一定程度上存在差异。由于各表型性状存在量纲差别，而变异系数正好消除了各性状之间的量纲区别，因此，变异系数具有可比性和代表性。根据表 1结果可知：叶先端尖削指数的变异系数最大，为50%，其它性状的变异系数在10%~50%间(上表皮细胞弯曲度指数除外，它的变异系数最小)。整体而言，本实验所选的水青树叶表型性状都存在较大的变异，其遗传多样性较高，证明这161个种质资源能较好的反应水青树的遗传变异。

分析水青树20个叶表型性状的主成分，获得了5个能够代表其性状的特征值(分析时，从每个原始变量里提取的信息，SPSS默认保留其>1的值)大于1的主成分，且其累积贡献率达到了87.692%(表 2，自第6主成分开始特征值小于1)。对以上所提取出的主成分分别计算各主成分值，并进一步利用主成分值对各个体进行聚类分析，以此来研究各个体间的亲缘关系。

采用随机取样法抽取10个比例的种质资源。随着抽样比例的增大，除CR外，叶表型性状的各参数均呈先逐渐增大后逐渐减小的趋势；其中，VR和VD在取样比例为35%时达到最大，此时CR和MD也相对较高(表 3)。因此，R6最能代表原种质，并得到56份核心种质。

用位点优先取样法来抽取10个比例的种质资源时发现，各取样比例的MD均较小，绝大部分为0；VD和CR均随取样比例的增大而呈现出相似的变化趋势，在取样比例为45%时达到最大(表 4)，而此时VR的值相对较高。因此，S8最能反映原种质各情况，并得到72份核心种质。

用偏离度取样策略构建水青树种质资源库时发现：MD的值大多接近0%；CR和VR值较大，但是VD值较小。从结果中可以得到，该种取样策略下，筛选出的最适种质资源应是45%取样比例下的种质(表 5)，即，D8为最适种质资源，共72份。

比较不同策略构建的核心种质(表 6)，位点优先取样策略构建得来的种质，其各表型性状的极差、均值和方差等值均大于随机和偏离度这2种策略；不仅如此，叶表型性状的变异系数在位点优先取样时最小，随机取样时却是最大的；MD在位点优先和偏离度取样时均为0；位点优先取样的VD远大于随机以及偏离度取样策略的VD；虽然位点优先取样法下的VR略小于其他2种方法，但综合考虑，位点优先取样策略更适合用来构建濒危植物水青树的核心种质资源库。因此，在相同的聚类方法下，结合位点优先取样策略一共构建了72份水青树核心种质资源。

由表 7可知：对初步构建的核心种质进行t检验，结果均不显著，这说明本次实验所构建的核心种质与原种质在遗传多样性上相差不大。检测种质各表型性状平均值、变异系数与原种质符合度发现，均值符合率达到94.4%以上；变异系数符合率也高达84.8%以上。因此，本次构建的核心种质资源库具有原种质中的各性状变异，且这72份种质是有效的。

利用主成分分析法确认最终得到的72份核心种质。表 8显示了各主成分解释原种质中原始变量总方差的情况。核心种质在第4个主成分之后特征值开始小于1，其4个主成分几乎包含了原种质各个原始变量80%以上的遗传信息，因此，保留4个主成分最为合适。构建的核心种质中，4个主成分的累积贡献率达到83.366%高于原种质的82.257%，可见，核心种质的贡献率高于原种质，这样有效的避免了种质的冗余。

由核心种质资源库^{[9, 34]}的概念可知，种质资源库中的核心种质要以尽可能小的群体数量且能够最大程度的保留原种质的遗传多样性，因此，评价构建的种质资源库是否合适，其关键步骤是检验构建的该种种质资源的遗传多样性高低和实用性的大小^[27]。通过比较各评价参数发现：MD、VD、CR、VR这4个参数能更好的反映出构建的种质资源库中的水青树种质与原种质在方差、变异系数等方面的差异^[35]。徐海明等^[29]研究结果表明，位点优先取样策略构建的种质资源库更优于偏离度取样策略。而在这3种取样策略中，随机取样策略虽然能够获得无偏样本，但其构建的核心种质代表性表，无法保留原种质有效的遗传多样性；相比之下，偏离度取样法却能最大程度的保留原种质的遗传以及变异，而位点优先取样法不仅可以保留原种质的最大性状值，还可以保留其最小性状值，与此同时原种质的遗传结构也能被保留下来^{[32, 36]}。因此，运用欧氏距离和瓦尔德法进行逐步聚类再结合位点优先取样策略来构建水青树的核心种质资源库，是最适合的方法。该结果与新疆野杏等^[13]的结果一致。

本次得到水青树种质资源库中共有72份核心种质资源，均是在比例为45%时构建。本次样株数只有161株，最佳取样比例为45%相较于其它样本数多的取样比例偏大。Brown^[34]认为，样品数超过3 000时，种质资源库的比例在5%~10%之间；目前大多认为种质资源库的取样比例在5%~40%之间^[37]，而李自超等^[31]认为，如果采集的样本数越少，它的取样比例也会相应变大。因此，本次构建水青树种质资源库的取样比例是合情合理的。

众所周知，植物的表型多样性是由其自身基因和所处的环境共同决定的^{[36, 38]}，对于不同的物种来说，引起其表型变异的主要因素不尽相同，有的是以环境为主导，有的则是由自身的基因所决定的。植物的表型变异是其遗传变异的前提，故而可以通过研究植物表型性状来推测其遗传变异的情况^[39]。李珊^[40]等在水青树叶表型变异的研究中还发现，虽然水青树各天然种群大生境间的异质性较差，水青树对环境变化的适应能力变低，但其叶表型分化仍处于中等水平。所以，叶表型的变异情况也能反映水青树遗传变异的情况。

本次构建的核心种质资源库拥有极高的特征值和累计贡献率，既避免了种质资源库的冗杂，又确保了它的代表性。本实验运用水青树叶这一营养器官的表型变异来探究其遗传性状是具有一定科学性的，且利用水青树叶表型性状探究构建的水青树核心种质资源库的策略，具有参考价值。同时构建的72份核心种质是有效的，为以后水青树种质资源的保护奠定了基础。