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刨花润楠(Machilus pauhoi Kanehira.)又名刨花楠,是樟科(Lauraceae)润楠属(Machilus)亚热带常绿乔木,常散生在海拔800 m以下的山坡灌丛或山沟疏林,幼龄期喜阴耐湿生长较缓慢,中龄期喜光喜湿生长迅速[1-3]。刨花润楠天然分布于我国的广东、广西、福建、江西、湖南、浙江和安徽等省(区),生长十分迅速并具有极强的萌蘖更新能力,采伐后通过伐桩萌蘖更新的林分生长速度更快,是我国南方地区重点发展的优良高产乡土树种之一[4-5]。刨花润楠应用范围十分广泛,是优质珍贵的用材树种,木材被广泛应用于家具制作和建筑装饰等领域;其新出嫩叶呈粉红色或红棕色,加之树形美观,亦可作为优美的庭院绿化与观赏树种应用;其木材、树皮富含胶质,树叶可提取精油,是上好薰香制品的主要工业原料;同时具有良好的防风固土和防火特性[2-3, 6-8]。总体而言,刨花润楠是经济价值与生态价值均较高的优良树种。目前,刨花润楠野生种质资源正受到日益严重的破坏,利用分子标记技术研究其遗传多样性,对该树种的保护和育种策略的制定等具有重要的理论和实践意义。
简单重复序列(SSR),又称之为微卫星,近年来,随着SSR分子标记技术的日趋成熟,因其具有共显性、操作简便、稳定可靠、重复性好、多态性丰富以及近缘属间具有一定的通用性等优点,已广泛应用于生物遗传多样性、基因定位、资源亲缘关系、品种鉴定和遗传图谱构建等方面[9-14]。
SSR是基于PCR技术的一种分子标记技术,其扩增结果易受反应体系中各因素的影响[15],稳定的PCR反应体系是进行SSR分析的前提。因此,本试验旨在利用单因素结合正交设计试验,对影响刨花润楠SSR-PCR反应体系的各因素进行逐步优化,建立稳定的反应体系。并借鉴樟科植物文献报道的SSR引物,筛选多态性高、稳定性和重复性好且适用于刨花润楠的引物,分析刨花润楠的遗传多样性特点、遗传结构与划分遗传类群,为制定保护和育种策略提供重要依据。
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从全国7省(区)24个刨花润楠天然林分中,选择生长良好、无病虫害的母树分单株采集成熟果实。母树间相距100 m以上,选择16株,数量不足者按实际单株量全部采集。经洗去果皮后,沙藏促其萌发,种植于广州市华南农业大学教学科研基地。次年,采集子代苗嫩叶用于DNA提取。种源信息见表 1和图 1。
省份
Province种源名称、代码及样本量
Provence Code and Sample capacity广西 兴安
XA (16)贺州
HE (12)昭平
ZP (13)灵川
GO (15)恭城
GT (11)阳朔
GR (8)福建 建瓯
JO (15)顺昌
NP (15)永春
YC (15)龙岩
LY (4)将乐
FO (6)江西 遂川
SC (15)安福
AF (16)全南
QN (11)崇义
CY (6)广东 仁化
RH (14)阳山
YS (14)乳源
RY (9)浙江 建德
ZF (14)温州
JD (15)平阳
PY (16)湖南 茶陵
HT (13)祁阳
HS (11)安徽 祁门
AS (4)Table 1. Information sheets about different provenances of Machilus pauhoi
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本研究所用SSR引物来源于樟科润楠属植物红楠(Machilus thunbergii Sieb. et Zucc.)和Machilus pseudokobu及鳄梨属植物鳄梨(Persea americana Mill)3个物种公开发布的187对SSR引物[16-21],由深圳华大公司合成。详细信息参见表 2。
Table 2. The source and information of SSR primer in M.pauhoi
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以展叶15 d左右的新鲜叶片为材料,采用EZNAⓇ high-performance DNA mini Kit试剂盒提取基因组DNA。使用0.8%琼脂糖凝胶电泳和超微量紫外分光光度计(Thermo NanoDrop1000)对提取的DNA进行质量、纯度和浓度检测。检测后,将浓度稀释至50 ng·μL -1,置于-20℃下保存备用。
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采用L16(45)正交试验设计(表 3),对模板DNA、Taq酶、Mg2+、dNTPs和引物进行5因素4水平筛选分析。反应体系总体积为20 μL,均含有2 μL 10×Buffer (Mg2+ free),根据实际情况,再补加重蒸水至20 μL。最后,以产物扩增条带清晰度,非特异扩增为标准,效果最好的记16,最差的记为1,对该组合评分数据用SPSS20.0进行方差分析[22-23]。
编号
No.Taq酶
Taq DNA polymerase/(U)Mg2+/(mmol·L-1) dNTPs/(mmol·L-1) 引物
Primer/(μmol·L-1)DNA/(ng) 1 0.75(1) 1.87 5(1) 0.187 5(1) 0.125(1) 20(1) 2 0.75 2.50 0(2) 0.250 0(2) 0.250(2) 30(2) 3 0.75 3.12 5(3) 0.312 5(3) 0.375(3) 40(3) 4 0.75 3.75 0(4) 0.375 0(4) 0.500(4) 50(4) 5 1.00(2) 1.875 0.250 0 0.375 50 6 1.00 2.500 0.187 5 0.500 40 7 1.00 3.125 0.375 0 0.125 30 8 1.00 3.750 0.312 5 0.250 20 9 1.25(3) 1.875 0.312 5 0.500 30 10 1.25 2.500 0.375 0 0.375 20 11 1.25 3.125 0.187 5 0.250 50 12 1.25 3.750 0.250 0 0.125 40 13 1.50(4) 1.875 0.375 0 0.250 40 14 1.50 2.500 0.312 5 0.125 50 15 1.50 3.125 0.250 0 0.500 20 16 1.50 3.750 1.187 5 0.375 30 Table 3. L16(45)orthogonal design of SSR-PCR reaction
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反应程序为:94℃变性9 min; 30个循环(94℃0.5 min,57℃0.5 min,72℃0.5 min);72℃延伸5 min;4℃保存。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳,并用凝胶电泳成像分析系统(美国伯乐)成像保存。
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用不同种源DNA和引物及其所对应的最适退火温度检验最佳体系, 最佳体系确定后进行引物筛选。先选用4个种源DNA进行初筛,再选用8个种源DNA进行复筛,扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,确定为有效引物后,扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶银染染色检测。
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确定有效的引物由上海生工生物工程公司完成PCR产物的毛细管电泳检测和数据收集工作。利用Convert1.31软件将SSR谱带统计结果进行数据多样格式转换。利用POPGENE1.32软件计算各群体观测等位标记数(Na)、观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He);利用PowerMarker v3.25软件计算每个SSR位点的多态性信息量(PIC);用FSTAT软件计算遗传分化系数(Gst),基因流Nm=Gst/4×(1-Gst);利用GenAlex6.5检测位点哈迪-温伯格平衡(HWE);利用Structure2.3软件进行群体遗传结构分析;采用POPTREE软件进行UPGMA法聚类分析。
1.1. 试验材料
1.2. SSR引物
1.3. 试验方法
1.3.1. DNA的提取与检测
1.3.2. PCR反应体系正交试验
1.3.3. PCR扩增程序
1.3.4. 引物筛选
1.3.5. 遗传多样性分析方法
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用超微量紫外分光光度计检测提取的DNA,OD260/OD280比值均在1.7~1.9之间,OD260/ OD230比值均在1.8~3.0之间,说明所提取的DNA纯度较高。使用0.8%琼脂糖凝胶电泳结果(图 2)表明:DNA均呈现一条清晰完整的主带,无拖尾和降解,无明显的RNA存在。因此,所提DNA可以适用于后续SSR分析。
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从正交试验产物电泳结果(图 3)可以看出:处理5、7、8和9的条带较清晰,结合经济成本等因素,最终确定处理5为最佳体系,各因素对应浓度分别为:Taq酶1.0 U,dNTPs 0.25 mmol·L-1,Mg2+1.25 mmol·L-1,引物0.5 μmol·L-1,DNA 50 ng。
应用SPSS20.0软件对这16个组合的评分数据进行方差分析,结果(表 4)表明:除引物外,Taq酶、dNTPs、Mg2+和模板DNA对试验结果影响均达到极显著水平。依据F值大小判断各因素对刨花润楠SSR-PCR反应体系的影响程度依次为:Taq酶> dNTPs>Mg2+>DNA>引物。
变异来源
Source平方和SS 自由度
DF均方
MSF-Value 校正模型 674.000 15 44.933 119.822** Taq酶 400.500 3 133.500 356.000** Mg2+ 92.000 3 30.667 81.778** dNTPs 171.000 3 57.000 152.000** 引物 1.500 3 0.500 1.333 DNA 9.000 3 3.000 8.000** 误差 6.000 16 0.375 总计 2 992.000 32 校正后误差 680.000 31 注:“**”表示P≤0.01差异极显著。
Notes: Symbol “**” means the variation was significantly different.Table 4. Variance analysis of orthogonal design
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用部分引物及其对应退火温度对最佳体系进行验证,图 4A、4B为琼脂糖凝胶电泳图,适用于引物初筛。可以看出,该体系稳定可靠,条带清晰,多态性高,非特异性条带少,适用于后续引物筛选。
图 4C、4D为通过银染染色的6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。因变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可将相差一至数个碱基的DNA链分开,分辨率高,因此,适用于对初筛引物的进一步复筛,通常会把复筛后的引物作为最终筛选引物。其中,图 4C为3对引物Mt59、Mt60和Mt61分别在8个种源(HT、YC、AF、ZF、RH、AS、QN和XA)DNA样本中的扩增条带图,图 4D为引物Mt146分别在2个种源(RH和XA)各15个家系DNA样本中的扩增条带图。由此可见,上述引物不仅能检测出不同种源间的差异,也能检测出种源内不同家系的差异,因此,可作为最终筛选引物。最终,从187对候选SSR引物中共筛选到具有多态性高的引物12对(表 5),可用于后续刨花润楠种群遗传多样性分析。
代码
Code正向引物序列(5’-3’)
Forward primer sequence(5’-3’)反向引物序列(5’-3’)
Reverse primer sequence(5’-3’)Mt59 F:ACCCAATCAACAAACAAACCC R:CGTTTCCCCAATCCATTTCT Mt60 F:CGAAGAAGGATAGTCTGAAAACCC R:GAGGAAGGATCGGAAGAGAGG Mt61 F:AACCCTAACGGATTTCAACTAC R:ACGGTATAGCTCCTTCCATTC Mt67 F:ACACCCAACAGATGTGGATAGATAAG R:CAGATGAAAAGAACATGGCATTGA Mt90 F:GCAAGGCATTACGATGTCA R:CTCTAGTGGACAAAATCGACAA Mt131 F:CAGAGAATACGGATCTTTGC R:GTTCGAAGAAGCCTCAGTTA Mt139 F:TTACCAGTGCTCCTGCTAAT R:TGCTCTCAAACCACTTCTCT Mt145 F:CCCTTTCCAAGTTTCCTAAC R:GTGCAGAGGTAAGTCACCAT Mt146 F:AGCATGAGAGCAGAATCAAG R:ATCCCAACAGAAGCAGTTTA Mt153 F:CCTCAGGTTGAGACCTACTG R:CGGTGGCCACTATTAACC Mt154 F:CTCTTCTTTTGCTTTGTTCG R:CGTTACGTTAACTGCATCTC Mt169 F:ATTGCTGCATTTTCTTGTTT R:AGGGATTAGTCCAACCATTT Table 5. SSR primer sequences of 12 SSR primers in M.pauhoi
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12对SSR引物在24个刨花润楠种源中均有多态性扩增(表 6),共检测到181个等位标记,观测等位标记数(Na)、观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)平均值分别为15.083、0.576和0.751。等位标记数(Na)是描述共显性SSR标记遗传多样性的最适参数,刨花润楠平均等位标记数Na=15.083,表明刨花润楠群体遗传多样性处于较高水平。多态性信息PIC介于0.575~0.861之间,表明筛选到的12对引物多态性较高。经检测,这12对引物均未偏离哈迪-温伯格平衡,各引物间相互独立,不存在连锁不平衡,适用于后续遗传多样性研究。
代码
Code观测等位标记数
Na观测杂合度
Ho期望杂合度
He多态性信息量
PIC哈迪-温伯格平衡检测
Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)基因流
NmMt59 12 0.635 0.715 0.683 ns 2.165 Mt60 13 0.544 0.798 0.773 ns 0.604 Mt61 13 0.476 0.604 0.575 ns 1.337 Mt67 12 0.361 0.742 0.703 ns 1.073 Mt90 7 0.519 0.672 0.611 ns 1.169 Mt131 11 0.542 0.696 0.660 ns 1.445 Mt139 28 0.463 0.803 0.787 ns 1.591 Mt145 23 0.790 0.835 0.816 ns 3.156 Mt146 16 0.913 0.875 0.861 ns 2.177 Mt153 11 0.406 0.642 0.594 ns 0.840 Mt154 15 0.712 0.874 0.859 ns 1.725 Mt169 20 0.552 0.757 0.742 ns 0.724 均值
Mean15.083 0.576 0.751 0.722 ns 1.500 注:ns表示没有显著偏离哈迪-温伯格平衡。
Note:Symbol “ns” means no significant deviations from Hardy-Weinberg equilibrium.Table 6. Genetic diversity parameters of 12 SSR primers in M.pauhoi
基因流(Nm)是植物种群间的基因流动形成的,种子植物群体间的最主要基因流是通过种子或花粉传播而产生[24-25]。当基因流>1时,说明种群间存在着频繁的基因交流,防止因遗传漂变引起的居群遗传分化,有利于保持群体的遗传稳定性[26]。刨花润楠群体间的基因流平均值为1.500,表明刨花润楠群体间存在频繁的基因交流。
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基于模型STRUCTURE运算结果分析刨花润楠遗传结构,24个种源被分为3组,或称为3个基因池(图 5)。第Ⅰ类主导基因池颜色绿色,包括福建3个种源JO、NP和FO;第Ⅱ类主导基因池颜色为蓝色,包括广西、福建和江西三省(区)8个种源,分别为:广西GO、GT、GR和XA 4个种源,福建YC和LY 2个种源,江西CY和QN 2个种源;第Ⅲ类主导基因池颜色为红色,包括除福建省外的其它6个省(区)13个种源,覆盖范围最广,种源数量最多。
依据Nei’s遗传距离对24个刨花润楠种源进行聚类分析(图 6),该聚类结果同STRUCTURE软件分析结果一致性较好,同样把24个种源分为3组。第一组包括福建种源JO、NP和FO(100/100),对应STRUCTURE分析中绿色基因池;第二组包括福建YC、LY,广西GO、GR、GT、XA,江西CY和QN 8个种源(75/100),对应STRUCTURE分析中蓝色基因池;第三组包括江西SC、AF,广西ZP、HE,湖南HT、HS,广东RH、YS、RY,浙江ZF、JD、PY和安徽AS 13个种源(55/100),对应STRUCTURE分析中红色基因池。