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杨树因具有速生、易繁殖、耐干旱等优点,通常被作为重要的公益林及用材林树种广泛的种植[1]。但是随着大范围、大面积杨树人工林的发展,诸多病虫害随之流行为害,给杨树的生长造成了重大影响。尤其是落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina Kleb., 简称MLP)导致的叶锈病最为普遍。叶锈病是杨树上的最严重病害之一,它可导致杨树过早的落叶,缩短发育期,显著降低杨树的生长量及蓄积量,其大面积流行造成了巨大的经济和生态损失[2-4]。因此,研究杨树的潜在抗锈病机制对病害防治和杨树育种具有重要意义。
目前,甲基化分析被广泛地用于探索植物、人类、昆虫中各种各样的潜在的遗传机制[5-6]。甲基化是一种重要的表观遗传修饰,常见的有DNA甲基化和组蛋白甲基化两种类型。其中DNA甲基化一般发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点)经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶;组蛋白甲基化可以发生在蛋白的赖氨酸和精氨酸的残基上,而且赖氨酸残基可以发生单、双、三甲基化,精氨酸残基可以发生单、双甲基化[7-8]。这些不同形式及程度的甲基化在转座子沉默、基因表达调控等生物学过程中起到重要的作用,常常会导致发育异常、癌症、重大疾病的发生,但同时也伴随着一些潜在促生长、抗疾病等优良基因的激活[9]。因此,研究甲基化对于深入理解基因表达、个体发育及抵抗疾病侵染等机制具有重要意义。
通过甲基磺酸甲醛(methyl methane sulfonate简写为MMS)处理诱导植物基因组DNA甲基化的研究在干旱胁迫、盐胁迫等非生物胁迫方面已进行了许多报道并取得一定成效[10-12],例如:Uthup等人报道橡胶树非生物胁迫下的DNA甲基化图谱并推断出了该树种某些基因表达随生境变化的相关关系[13]。毛果杨(Populus trichocarpa(Torr. & Gray))干旱胁迫下的甲基化分析证明,DNA甲基化可使一些潜在沉默基因得以表达以适应所处的干旱情况,表明了表观遗传机制研究在多年生植物对环境适应方面的重要性[1, 14];虽然对植物的一些病虫害等生物胁迫条件下的甲基化研究仍鲜有报道,但从甲基化处理感染丛枝病的泡桐,可以使其恢复正常生长[15],可以看出甲基化处理在植物抗逆和抗病等方面显示出良好的潜力。太白杨是松杨栅锈菌天然的寄主之一,蕴藏着丰富的抗病遗传资源和较强的生长适应能力,本研究旨在探讨甲基化处理对太白杨幼苗的生长调控是否可以改善其对松杨栅锈菌的抗锈菌能力,以期为杨树的抗锈性育种和抗锈性机制研究提供理论依据。
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不同浓度的MMS处理对太白杨在第1天均没有显著差异;第3天0.7 μmol·L-1的MMS处理的太白杨32.7%叶片出现卷曲波浪状或叶边缘内收现象,11.2%叶片出现黑色叶斑;0.5 μmol·L-1的MMS也出现了叶片边缘的略微卷曲或边缘内收,但无黑斑出现;0.2 μmol·L-1的MMS无显著的形态变化。第5天0.7 μmol·L-1的MMS处理的太白杨有26.66%开始停止生长叶片出现萎蔫,较严重的已出现死亡,所有植株上都存在具有黑斑的叶片,并且黑斑往往最早出现在叶龄较大的叶片上。第7天时所有MMS处理中植株死亡率、叶卷曲率、黑斑率的增长率达到最大值,随后的第9天及第11天叶片受损情况趋于平缓。总的来说0.5 μmol·L-1与0.7 μmol·L-1的MMS处理的太白杨出现两种极端,初期苗势生长弱的植株叶片出现大量黑斑进而萎蔫死亡,而生长势强的幼苗叶片波浪状卷曲或边缘内收,叶片颜色加深呈深绿色革质变强。但杨树在0.7 μmol·L-1的MMS处理下的适应率远远低于0.5 μmol·L-1MMS的处理。0.2 μmol·L-1的MMS处理没有出现植株的死亡现象,但同样出现了叶边缘内收,叶片颜色加深革质增强(图 1、2)。
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在不加MMS只接种松杨栅锈菌的太白杨在接种后第6天叶片开始在出现发病症状,叶片正面主叶脉之间出现略微发黄,但背面发病不明显(图 3A、B),加MMS处理苗则无发病症状。在接种锈菌后第7天,0.2 μmol·L-1 MMS与0.5 μmol·L-1 MMS试验组太白杨叶片背面均开始有夏孢子堆形成,但0.7 μmol·L-1 MMS处理的太白杨于第9天才开始有夏孢子堆的产生,潜育期被延长了2天(表 1)。第11天所有处理夏孢子堆密度趋于稳定。MMS处理对落叶松杨栅锈菌具有显著的抑制作用,并且抑制效果随MMS浓度的增加而增强,其中0.2 μmol·L-1 MMS处理对落叶松杨栅锈菌侵染的抑制率为28.14%;经0.5 μmol·L-1 MMS处理发病抑制率为39.68%;经0.7 μmol·L-1 MMS处理发病抑制率为67.33%(表 1)。
MMS浓度MMS concentration/(μmol·L-1) 潜育期Latent period/d 夏孢子堆密度Uredinial density/(个·cm-2) 7dpi 9dpi 11dpi 0.0 6±0.667 11.52±4.894 24.71±4.460 34.68±4.270 0.2 7±0.933 8.00±3.364 20.64±4.803 24.92±2.344 0.5 7±0.599 7.48±3.066 18.00±2.986 20.92±5.716 0.7 9±1.000 0.00 7.48±1.110 11.33±1.797 Table 1. The situation of leaf rust under different MMS concentrations
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在MMS处理调控杨树生长中,超氧化物歧化酶(SOD)具有一个先上升后下降再上升的相对趋势(图 4)。在第1天所有加入MMS的试验组中SOD都较空白对照呈现上调(高于对照组),且上调幅度与MMS的浓度具有一个正相关关系。在第3天以后所有试验组中SOD酶活性较对照组下调(低于对照),并在第5天达到下调最大值,然后SOD在第7天又出现上升趋势,其中0.2 μmol·L-1 MMS与0.5 μmol·L-1 MMS在随后第9、11天具有一个类似的上升幅度,在11天时SOD活性与对照组基本相同。但在0.7 μmol·L-1 MMS的试验组中SOD在第9天较第7天又出现一定程度下降,而后直至第11天SOD活性基本处于稳定状态且显著低于对照组。过氧化物酶(POD)活性在所有MMS处理的太白杨叶片中较空白对照均呈现下调(低于对照组),并具有一个先下降后上升的相对趋势,其中第5天为变化的转折点即达到下调的最大值。此外POD在0.2 μmol·L-1 MMS与0.5 μmol·L-1 MMS试验组中变化趋势较为相同,在第911天中与对照组没有显著的区别,而0.7 μmol·L-1 MMS的试验组中POD活性在第711天中趋于稳定且远小于对照组。在所有MMS处理的试验组中过氧化氢酶(CAT)活性较对照组在各时间段均呈现上调(高于对照组),在第1天上调幅度最大,而后所有试验组CAT活性均呈现一个下降相对趋势,并于第11天时恢复到对照组水平。多酚氧化酶(PPO)活性总体同样呈现出一个先上升后下降的趋势且整体水平较对照组要高。第1天PPO在不同试验组之间没有显著的差异,但随时间的推移0.2 μmol·L-1 MMS与0.5 μmol·L-1 MMS试验组中PPO分别在第3天和第5天达到一个峰值,0.7 μmol·L-1 MMS的试验组则在第3、7天分别出现一个峰值,且第3天出现的峰值更为显著。在PPO活性出现第一个峰值的时间点上0.7 μmol·L-1MMS与0.5 μmol·L-1MMS试验组都为第3天较0.2 μmol·L-1 MMS试验组的峰值时间(第5天)更早,且0.7 μmol·L-1MMS试验组上调幅度最大。
在锈菌侵染过程中,接种锈菌后前5天所有试验组超氧化物歧化酶(SOD)都较各自未接菌处理具有显著的提高,并且可以看到未接菌MMS处理的叶片较对照组(CK)整体水平处于下调,接菌后SOD整体水平均超过了对照组。接菌的各处理组SOD总体都处于一个相对下降趋势,最终在接菌711天导致接菌组SOD水平显著低于不接菌组。总的来说锈菌的侵入对SOD起到了一个先上调后下调的作用,转折点在第6天左右。过氧化物酶(POD)除0.7 μmol·L-1 MMS试验组在接菌处理后各个时间段较不接菌组呈现稳定上调且在第5天出现一个上调峰值,其他浓度MMS试验组接菌后第1天POD均出现下调,在第3天出现显著上调并达到峰值点,随后POD出现下降趋势至第911天时接菌处理组的POD活性水平低于未接菌组。接菌各组过氧化氢酶(CAT)较不接菌各组整体为先上升后下降的相对趋势,在前5天表现为上调且第3天处于上调最大值,第711出现下调。多酚氧化酶(PPO)与CAT变化规律相似,但在接菌后第1天PPO活性上升不明显,图 5。
从第7天产生夏孢子开始,通过夏孢堆密度与生物酶活性的相关性分析,仅多酚氧化酶(PPO)与夏孢子密度呈现一个显著的负相关关系(P=0.024),这说明PPO活性具有一个直接增强杨树抗锈病能力的作用(表 2)。
组别Group SOD POD CAT PPO 夏孢子密度 Pearson相关系数(r) -0.095 0.136 0.198 -0.309 显著性水平(P) 0.300 0.162 0.241 0.024 Table 2. Correlation analysis of different enzyme activities and urediospore density