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桉树焦枯病是由丽赤壳属(Calonectria spp.)真菌引起的世界性病害,主要发生在桉树幼苗和4年生以下的人工幼林[1-2]。该病原菌可侵染桉树幼茎、叶片、枝杆、树梢等多个部位,使苗木猝倒、根腐,叶片焦枯、卷曲脱落,枝条枯死,造成桉苗腐烂病以及生长后期的焦枯、顶枯、叶枯病。在我国广东、广西、海南、福建、台湾等桉树苗圃和人工林都有不同程度的发生,每次病害流行均导致大面积桉树林枯萎死亡,造成桉树人工林生产量明显下降[3-4]。据估计,福建省因该病害造成的年经济损失达0.518亿元[5]。桉树具有丰富的遗传资源,不同品系对焦枯病菌的抗性存在明显差异[6-8]。
苯丙烷代谢途径是植物体中一条重要的代谢途径[9-10]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶,主要负责催化L-苯丙氨酸脱氨形成反式肉桂酸,后者是植物合成木质素、植保素、黄酮、类黄酮等多种酚类次级代谢产物的前体物质,这些次级产物在调节植物生长发育及提高抗逆性中起着重要作用。目前,已从植物中克隆到多个PAL基因并研究了相应功能[11-12]。大多数植物PAL基因的编码序列长度约为2 100 bp,包含2个外显子和1个内含子,其中,外显子长度分别约为400、1 700 bp,内含子的位置相对保守,但长度差异很大。植物PAL蛋白一般含有PAL-HAL、PLN02457及phe_am_lyase三个保守结构域,其中,酶活性位点在PAL-HAL结构域上。植物PAL活性与其抗病性密切相关[13],在病原物侵染后,PAL活性往往呈现出先升高后下降的趋势,且抗病品系PAL活性高于感病品系[14]。水稻感染稻瘟病、小麦感染白粉病和赤霉病、玉米感染黑穗病、锥栗感染疫病后的PAL活性均出现上述变化趋势[15-19]。桉树PAL基因较少研究,PAL基因对桉树抗焦枯病菌的作用也未见报道。本研究从尾细桉M1基因组中克隆到1个PAL基因,并进行了生物信息学分析,探讨了接种Ca. pseudoreteaudii后不同品系PAL基因的表达特征,为进一步研究PAL基因在桉树抵抗焦枯病菌侵染的作用机制奠定基础。
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抗病品系尾细桉M1(Eucalyptus urophylla × E. tereticornis M1)和中感品系尾巨桉3229号(E. urophylla × E. grandis 3229)、感病品系巨桉5号(E. grandis 5)扦插苗及桉树焦枯病菌(Calonectria pseudoreteaudii YA51)由福建农林大学森林保护研究所提供[6]。质粒pDoner207由福建农林大学功能基因组研究中心惠赠。孢子悬浮液的配制参照Feng等[20]的方法。
将15棵桉树扦插苗(苗龄3个月,苗高25 cm)栽植于带土花盆,并置于人工气候箱(昼夜温度分别为25℃和23℃,相对湿度90%,光暗时间比14/10)中适应性培养7 d后,用75%酒精消毒,再用ddH2O冲洗23遍,将浓度为2.0×105 个·mL-1的分生孢子悬浮液均匀地喷洒于植株上,再置于人工气候箱保湿培养。分别于接种后0、12、24、48、72 h采集叶片,每个时间点从不同幼苗上采集的叶片混合在一起,液氮速冻后-80℃冰箱保存备用。
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按照Plant Genomic DNA Kit(TIANGEN)的说明书提取尾细桉M1的基因组DNA。
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采用改良CTAB法提取桉树总RNA [21]。检测合格后,以总RNA为模板,按照ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)说明书合成cDNA,置于-20℃备用。
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根据巨桉(E. grandis)PAL基因(Eucgr.J01079.1)cDNA序列在其可能的开放阅读框两端设计引物(表 1)。以尾细桉M1的基因组DNA为模板,分两段克隆PAL基因。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性15 s,60℃退火15 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃保温5 min,4℃保存。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,并回收目的片段。采用重叠延伸扩增技术(SOE)连接两个目的片段。第一步反应体系:10× LA Buffer 5 μL,dNTP mix 2 μL,Templax 1 1 μL,Templax 2 0.5 μL,LA Tag 0.25 μL,ddH2O补足48 μL,反应程序:95℃预变性3 min;94℃变性30 s,64℃退火1 min,72℃延伸1 min,10个循环;72℃保温7 min,4℃保存。第二步反应体系:第一步反应产物48 μL,引物F1 1 μL,R2 1 μL,反应条件:94℃预变性4 min;94℃变性40 s,60℃退火40 s,72℃延伸2 min,30个循环;72℃保温7 min,4℃保存。电泳检测目的条带,回收纯化后连接到pDoner207,并用Gateway技术进行BP反应,转化DH5α感受态细胞,菌液PCR鉴定为阳性克隆后,送至上海华大基因生物技术有限公司测序。
基因名称
Gene name用途
Function序列
Primer sequence (5’-3’)片段长度
Length of fragment/bpPAL Clone F1:ATGGAGATGGAGAGCACC
R1:CTTATAAGTTCCTTCTGCAAAG398 PAL Clone F2:TTGCAGAAGGAACTTATAAGGTTCTTGAATGCCGGGAT
R2:CTAAGAGATGGGAAGAGGAG1 750 PAL RT-PCR F3:TCGAGTCCAGTACGAGACAGG
R3:CTAAGAGATGGGAAGAGGAGCAC241 Actin RT-PCR F:TTCTACTATGTTCCCAGGTATCGC
R:GACCAGATTCATCATACTCACCCT194 Table 1. Primers used for cloning and real-time PCR
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利用ORF finder预测基因的开放阅读框(ORF)和编码序列;采用NCBI的Blast工具分析核苷酸和氨基酸序列相似性;利用ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html)在线分析氨基酸序列的理化性质;采用ProtScale分析蛋白质的疏水性/亲水性;采用NetPhos分析蛋白的磷酸化位点;利用SOPMA分析蛋白的二级结构;利用MEGA7.0软件及邻接(NJ)法构建进化树。
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以Actin(Eucgr.I00241.1)为内参基因,根据SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)的操作说明,在荧光定量PCR仪(Eppendorf)上分析不同桉树品系PAL基因在焦枯病菌胁迫下的表达情况。反应体系:1 μL cDNA,0.3 μL F3,0.3 μL R3,5 μL SYBR Premix ExTaq,ddH2O补足10 μL。反应条件:95℃ 2 min;95℃ 30 s,60℃ 15 s,68℃ 20 s,40 cycles。每个样品技术重复3次,以0 h为对照,以2-△△CT方法分析相对表达量。