Extraction, Purification and Microscopic Observation of Rubber Particles Extracted from Eucommia ulmoides

植物材料于2018年取自种植于贵州大学农业生物工程研究院实验农场杜仲资源圃中的多年生杜仲植株的当年生叶片及翅果。

仪器：水平离心机(ThermoFisher Scientific Inc.)，Allegra X-30R Centrifuge定角(45度)离心机(Beckman Coulter Inc.)，BX43光学显微镜(OLYMPUS Inc.)，S3400扫描电子显微镜(Hitachi Inc.)，e-1010离子溅射仪(Hitachi Inc.)，电子天平(北京丹佛仪器有限公司)，PH计(上海洪纪仪器设备有限公司)等。

试剂：三羟甲基氨基甲烷(Tris)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、β-巯基乙醇(BME)及抗坏血酸(Vc)购于Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司，氟化钾(KF)、硫酸镁(MgSO₄)，异丙醇(isopropanol)、盐酸(HCl)购于天津市科密欧化学试剂有限公司，2.5%戊二醛固定液购于Solarbio(北京)科技有限公司。

按照不同月份(6、7、8、9、10和11月)分别采收杜仲植株叶片(6—11月)及翅果(6—10月)，擦去表面灰尘后置于自来水下冲洗干净，用干净的吸水纸吸干植物材料表面的水分后用液氮速冻，保存于-80℃超低温冰箱备用。

参照赵德刚博士后出站报告^[4]及王惠^[23]硕士论文中杜仲胶颗粒提取方法并略作修改。取-80℃超低温冰箱冻存的新鲜杜仲叶(或翅果)加入组织研磨杵中用液氮迅速研磨成粉，称取适量样品粉末至含有400 mL预冷提取缓冲液的1 L烧杯中，于冰上快速搅拌抽提1 min，之后将组织匀浆液在4℃条件下迅速过200目不锈钢筛网并收集滤液，滤液分装于6支4℃预冷的50 mL离心管中备用。滤液分别按以下2种方法进行离心操作：①离心管在4℃条件下以5 000 g水平离心10 min后，小心取出后利用20 mL干净注射器将6支离心管中上层悬浮物合并转移至3支洁净的10 mL离心管中备用；②离心管在4℃条件下以5 000 g定角(45度)离心10 min后，分别以注射器收集液面漂浮物和以移液枪收集贴附于临近液面上层管壁处的悬浮物，合并后转移至3支洁净的10 mL离心管中备用。分别将上述2种处理获得的合并悬浮物于冰上放置30 min，于4℃，5 000 g水平离心8 min，弃去下清液，加入8 mL预冷的漂洗缓冲液重悬后，4℃，5 000 g水平离心8 min，弃去漂洗液，再次以漂洗缓冲液重悬、离心，重复6~8次。提取缓冲液：100 mmol·L^-1 Tris-HCl，50 mmol·L^-1 KF，2%(W/V)Vc，5 mmol·L^-1 MgSO₄，pH=7.5)，临用前加入2%(W/V)PVP，β-巯基乙醇(终浓度为5 mmol·L^-1)，0.1 mmol·L^-1 PMSF异丙醇溶液。漂洗缓冲液：100 mmol·L^-1 Tris-HCl，5 mmol·L^-1 MgSO₄，10 mmol·L^-1 β-巯基乙醇。

准确称取-80℃冻存的、采摘于10月的杜仲叶(或翅果)100 g于组织研磨杵中加入液氮迅速研磨成粉，迅速转移至预冷的400 mL提取缓冲液中，于冰上快速搅拌抽提1 min，将组织匀浆液在4℃条件下过200目不锈钢筛网并收集滤液，滤液转移至50 mL离心管中，再按照1.2.2中第二种方法对样品进行杜仲胶颗粒提取。将第一次过滤所得植物样品分别按照不同次数(1、2、3、4、5和6次)再次研磨(无需加液氮研磨)，每研磨一次约10 min，提取缓冲液浸提过滤2次，同时烘干提取纯化后的杜仲胶颗粒。计算出杜仲样品在不同研磨次数处理后杜仲胶颗粒得率。

精确称取-80℃冻存、取自不同月份的杜仲叶片(6—11月)和杜仲翅果(6—10月)各100 g，结合1.3.3方法中植物样品6次研磨10次过滤，滤液采用1.3.2方法中经4℃条件下5 000 g定角离心(45度)10 min提取杜仲胶颗粒；同时烘干提取纯化后的杜仲胶颗粒，计算杜仲胶颗粒在不同生长期杜仲叶或翅果中的含量，分析不同杜仲组织中胶颗粒含量随月份变化的动态积累规律。另外，利用OLYMPUS BX43光学显微镜对提取的胶颗粒大小进行观察，并以其自带测量工具对各生育期不同杜仲器官组织中胶颗粒大小进行测定，每组设3个重复。

取10月杜仲叶片和翅果提取纯化后的胶颗粒(约0.002 g)样品于干净的载玻片上，加1滴漂洗缓冲液悬浮胶颗粒，加盖盖玻片后置于OLYMPUS BX43光学显微镜(1 000×)下观察胶颗粒形态，同时以OLYMPUS BX43自带测量工具对采自10月的样品材料中的胶颗粒进行粒径测量，并对光镜观察拍摄的胶颗粒按粒径大小进行分类、统计。选取同一视野中3个等面积的区域进行分析，每组重复3次。另取同时期纯化的叶片和翅果胶颗粒各(0.1 g)于2 mL离心管中，加入1.8 mL 2.5%的戊二醛固定液于4℃冰箱固定4 h。取固定好的胶颗粒均匀涂布在干净盖玻片上室温过夜晾干，利用日立e-1010离子溅射仪镀金后直接用日立S3400扫描电子显微镜观察杜仲胶颗粒形态。

由图 1A可以看出，抽提滤液经4℃，5 000 g水平离心10 min后发现，杜仲叶及翅果提取液表层有少量乳白色漂浮物，且翅果(S)中乳白色漂浮物较叶片(L)中多；而抽提滤液以4℃，5 000 g定角离心(45度)10 min后无论杜仲叶片和翅果提取液表层和离心管壁均富集了大量乳白色颗粒物(图 1B)。镜检结果表明，该乳白色漂浮物即为杜仲胶颗粒，说明以45度定角离心有利于杜仲胶颗粒的提取。进一步利用光镜对粗提和纯化的胶颗粒观察发现，粗提杜仲胶颗粒含有较多细胞及组织碎片，经过纯化提取处理的杜仲胶颗粒纯度较高，杂质污染少。通过不同离心条件比较，确定杜仲胶颗粒提取的最佳离心条件为：4℃，45度定角，5 000 g离心10 min胶颗粒的得率最高。

Figure 1.  Effect of different centrifugation conditions on extraction ratio of E.ulmoides rubber particles

对液氮首次研磨过滤后的杜仲样品进行不同次数研磨提取发现，随着捣碎研磨次数的增加杜仲胶颗粒的提取得率也显著上升(图 2)。当研磨1次时，杜仲胶颗粒提取率仅为0.54 g·kg^-1，研磨3~5次时，杜仲胶颗粒得率分别为2.36 g·kg^-1、3.31 g·kg^-1、3.70 g·kg^-1，说明充分研磨植物材料有利于细胞壁的破碎进而释放出更多的杜仲胶颗粒。其中胶颗粒提取率在研磨次数达到第2、3、4次时增加最快。当研磨次数达到4次时，杜仲胶颗粒的提取率增幅不显著，趋于恒定。通过比较不同研磨次数对杜仲胶颗粒得率分析表明，过滤后的植物材料经6次研磨能充分破碎细胞并释放出大量的胶颗粒。

Figure 2.  Effect of grinding numbers on the extraction rate of E. ulmoides rubber particles

对不同生长期杜仲叶及翅果胶颗粒积累规律进行分析，结果如图 3所示。随着杜仲叶片和翅果生长发育的成熟其胶颗粒的积累量不断增多，当发育达到成熟后胶颗粒的含量趋于稳定。其中，6—10月份杜仲叶片胶颗粒积累量低于翅果。胶颗粒粒径测定结果表明，随着杜仲翅果生长发育的成熟，杜仲翅果胶颗粒粒径呈不断增大的趋势，到9月份以后杜仲翅果胶颗粒大小变化趋于恒定，如图 4所示。随着杜仲叶生长发育的成熟，杜仲叶片胶颗粒粒径呈不断增大的趋势，到10月以后杜仲叶片胶颗粒粒径大小趋于稳定，变化极小(图 5)。可能是6—7月份杜仲生长代谢旺盛，胶颗粒进行橡胶分子的合成速度较快，使胶颗粒粒径不断增大；9—10月温度和光照强度降低，杜仲叶果合成代谢速度减慢，导致胶颗粒粒径变化趋于稳定。

Figure 3.  Accumulation of rubber particles in E.ulmoides leaves and samara in different months

Figure 4.  Variation of particle sizer of E.ulmoides rubber particles in samara

Figure 5.  Variation of particle size of E.ulmoides rubber particles in leaves

从图 6A、B、C可以看出，杜仲胶颗粒在光镜下呈球形，不同器官中胶颗粒形态差异较大。杜仲叶胶颗粒大小总体表现为均一化程度一致，两级分化较低，而杜仲翅果胶颗粒均一化程度较差，表现为小胶颗粒含量(粒径为1 4 μm)最多，中等大小胶颗粒含量(4 7 μm)次之，大胶颗粒(7 11 μm)含量最低。电镜对叶和果中的胶颗粒观察也发现两者中的胶颗粒形态存在一定差异(图 6D，E)。杜仲树皮胶颗粒主要以1 4 μm小胶颗粒数量最多，中等胶颗粒和大胶颗粒含量极少。进一步对各不同大小胶颗粒在胶颗粒中所占比例分析发现，杜仲叶中粒径为1 4 μm小胶颗粒占39%，粒径为4 7 μm中等胶颗粒占38%，粒径为7 11 μm大胶颗粒占23%；杜仲翅果中粒径为1 4 μm的小胶颗粒占53%，粒径为4 7 μm的中等胶颗粒占34%，粒径为7 11 μm的大胶颗粒占13%；杜仲树皮中粒径为1 4 μm的小胶颗粒占98.38%，粒径为4 7 μm的中等胶颗粒占0.12%，粒径为7 11 μm的大胶颗粒占0.05%。推测不同器官组织中胶颗粒大小差异可能各器官的特定功能或不同器官中杜仲胶分子量大小有一定关系。

Figure 6.  Microscopic observation of the E. ulmoides rubber particles separated from leaves, samara and barks

杜仲胶颗粒是合成杜仲胶的重要细胞器，尽管杜仲胶颗粒广泛分布于杜仲叶片、果皮、树皮等多个器官组织中^[24]，相较巴西橡胶(H. brasiliensis Muell. Arg.)胶颗粒的分离及提取工艺，杜仲胶颗粒提取步骤复杂，进而限制了对于杜仲胶颗粒的深入研究。笔者在赵德刚^[4]、王敏杰^[20]及王惠^[23]等研究者前期工作的基础上，建立了杜仲胶颗粒提取条件操作简捷、重复性好、提取率高，且适用于不同生长期(6—11月)杜仲叶、翅果及树皮等器官中杜仲胶颗粒的提取。研究结果表明，不同生长期的杜仲器官组织经多次研磨、抽提及定角离心后可获得较高含量杜仲胶颗粒。光镜和电镜观察结果表明，杜仲胶颗粒呈球形，组织碎片等杂质含量较少，胶颗粒纯度较高。进一步通过对不同杜仲器官中胶颗粒粒径大小分析发现，杜仲叶、翅果和树皮提取的小胶颗粒(1 4 μm)的比例依次增多(分别占39%，53%，98.38%)，中等胶颗粒(4 7 μm)和大胶颗粒(7 11 μm)依次减少，相关研究报道杜仲叶、树皮及种皮中杜仲胶平均分子量分别为Mw=7.5×10³，Mw=4.3×10⁵和Mw=5.1×10^5[25]，推测杜仲叶中尽管中等及大橡胶颗粒相对翅果较多，可能以低分子量杜仲胶分子为主，而杜仲翅果中尽管小橡胶颗粒相对叶片较多，可能以高分子量杜仲胶分子为主。对10月份采集的杜仲叶和翅果胶分子量进行测定，发现叶片中杜仲胶颗粒内部橡胶分子质量分布有5个峰值，杜仲胶平均分子量为Mw=1.83×10⁴，翅果中杜仲胶颗粒内部橡胶分子质量分布有2~3个峰值，杜仲胶平均分子量为Mw=4.15×10⁴，两者差异达到显著水平(P < 0.05)。同时，杜仲翅果中杜仲胶分子量分布(D=Mw/Mn)比叶片宽，杜仲叶和杜仲翅果的D值分别为6.76和40.61，表明尽管杜仲叶中不同大小分子量的胶分子含量较多，但分布较为集中，而杜仲翅果中不同大小分子量的胶分子含量较少，但分布较为分散(另文发表)。另外，通过对杜仲各生长期(6—11月)叶片及翅果中胶颗粒粒径及胶颗粒积累变化分析表明，胶颗粒粒径大小随杜仲叶和杜仲翅果的发育成熟而不断增大，胶颗粒积累量均呈先增加后稳定的变化趋势，其中杜仲翅果中胶颗粒含量在10月份时达到最大值，为5.37 g·kg^-1，之后不再增加；而杜仲叶中胶颗粒含量在10月份时为3.70 g·kg^-1，之后含量增加不显著。利用该法提取的杜仲胶颗粒纯度及得率相较赵德刚^[4]、王敏杰^[20]及王惠^[23]有显著改善，且不受取材时期的限制。本研究提取的胶颗粒可为深入研究杜仲胶颗粒的膜质组分及杜仲胶合成相关研究提供基础。

本研究采用不同离心条件对杜仲胶颗粒进行提取，结果表明在4℃条件下，以5 000 g离心力45度定角离心杜仲胶颗粒的提取得率最高。进一步通过对粗研磨样品进行复研磨发现，当滤渣样品经5次复研磨后，杜仲样品中大量胶颗粒已被提取分离出来。通过对不同生长期(6—11月)、不同杜仲器官中胶颗粒含量分析表明，随着杜仲叶片和翅果随着发育的成熟杜仲胶颗粒的积累量和粒径呈先增大后稳定的变化趋势，其中翅果胶颗粒含量在各发育阶段均显著高于杜仲叶片；显微观察结果表明，利用此法提取的杜仲胶颗粒形态完整，细胞碎片等杂质较少，可为进一步分析胶颗粒组成、形态发生以及阐明胶颗粒与杜仲胶含量以及分子量大小提供理想的实验材料。