Cloning and Rhythmic Expression Analysis of LgFKF1 Gene in Luculia gratissima

以馥郁滇丁香品种‘香妃’扦插苗为试材。于2016年12月15日扦插，当生根的幼苗新长出2～3个茎节时，去除所有植株的顶端分生组织，并移入非诱导光周期（22：00～2：00暗中断补光，光照强度为1.8～2.3 μmol·m⁻²·s⁻¹）的温室中培养；同时，在自然环境中放置部分植株设为对照。当对照植株出现花芽分化后，开始进行诱导光周期（光照/黑暗为10 h/14 h）处理。

根据前期的转录组测序结果为依据，选取诱导光周期处理7、10、13、19 d 4个时间点取样。每个时间点随机选10株单株，每个单株取主枝上的1个芽，共10个芽，采集的样品液氮速冻后-80℃保存。等量混合4个时间点的样品进行cDNA全长序列克隆。

参照万友名等^[12]的方法，将非诱导光周期中培养的植株移入诱导光周期中进行诱导处理。自处理开始，每隔3～5 d随机选取10株植株，每株采集健壮主枝上的顶芽1个，共10个芽混合为1个样，重复3次。与此同时，每次都采用相同的方法在非诱导光周期中采集样品设为对照。每次在上午9：00—11：30采样。采样自诱导光周期处理开始至花蕾现蕾。所有样品采集后液氮速冻并保存在−80℃冰箱中用于qRT-PCR分析。然后，根据万友名等^[12]的形态学观察结果，选取诱导光周期处理7 d（未分化期）、10 d（总苞原基分化期）、13 d（花序原基分化期）、19 d（小花原基分化期）4个时间点的样品及其对照样品进行qRT-PCR分析，共24个样。

于‘香妃’的盛花期，选取一天24 h，从早8：00开始，每隔3 h从种植条件一致的同一批试验材料中分别采集根（T1）、茎（T2）、叶（T3）、营养芽（T4）、着色期花蕾（T5）、露白期花蕾（T6）及开放的花朵（T7）1次，每次每个组织取300~500 mg，重复3次。所有样品采集后立即液氮速冻并保存于-80℃冰箱中用于qRT-PCR分析。

样品经液氮研磨后，按照生工生物工程（上海）公司提供的柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒（SKB8661）说明书操作提取总RNA。利用第一链cDNA合成试剂盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase）(Thermo Scientific^TM EP0733)按说明书操作将提取的RNA反转录成cDNA。

以转录组测序结果为基础，经信息分析获得与FKF1功能相似的Unigene片段，并命名为LgFKF1。采用Primer premier 5.0软件设计引物（表1）。然后，以合成的cDNA为模板，利用LA Taq(TaKaRa DRR02AG)进行PCR扩增，具体方法按照说明书操作。PCR反应条件为：95℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，33个循环，72℃ 修复延伸7 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。采用柱式DNA胶回收试剂盒（生工B518131）回收目的条带。回收的目的片段连接pGM-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，筛选阳性克隆送至生工生物工程（上海）公司测序。

克隆拼接获得的序列经NCBI的ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析翻译成氨基酸序列，然后，通过BLAST（http://b-last.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行蛋白序列的同源性比对，同时，选取部分相似度高的同源蛋白序列利用DNAMAN5.1软件进行同源性比对；利用ProtParam（http://www.expasy.org/tools/protp-aram.html）在线工具软件预测分析蛋白的理化性；利用ProtScale（https://web.expas-y.org/cgi-bin/pro-tscale/protscale.pl）进行亲/疏水性预测分析；利用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测蛋白的信号肽；利用PROTTER（http://wlab.e-thz.ch/protter/start/）建立蛋白跨膜结构模型；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在线软件分析蛋白的二级结构组成；利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）同源建模方法得到蛋白的三维预测模型；利用ProtComp9.0(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&grou-p=programs&subgroup=proloc)进行亚细胞定位预测；利用MEGA5.0软件构建蛋白系统进化树。

总RNA的提取及cDNA反转录同上，引物详见表1。以cDNA为模板，LgACT为内参基因，在LightCycler480 II上按照罗氏公司的SG Fast qPCR Master Mix（2×）(B639271)说明书进行qRT-PCR反应。反应体系为：SybrGreen qPCR Master Mix（2×）10 μL，上、下游引物（10 μmol·L⁻¹）各0.4 μL，ddH₂0 7.2 μL，cDNA模板2 μL，总体系共20.0 μL。反应条件为：95℃预变性90 s，95℃变性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，40个循环。所有样品反应设3次技术重复。

利用2^−ΔΔCT法计算基因的表达量。采用Excel2010和SPSS16.0进行数据整理及绘图。

将转录组获得的LgFKF1核心序列与克隆的5xRACE序列、3xRACE序列（图1）比对拼接后，获得LgFKF1的cDNA全长序列。利用DNAMAN5.1软件对序列分析表明：该序列片段大小为2 271 bp，A、C、G、T碱基含量分别为26.9%、18.5%、26.1%、28.5%。经NCBI的ORF Finder软件分析，LgFKF1基因开放阅读框为1 917 bp，编码一个638个氨基酸的蛋白质（图2A）。将翻译成氨基酸的序列用BLASTp比对表明：该序列与扁果树（Kaliphora madagascariensis AML77708.1）、软枝黄蝉（Allamanda cathartica AML77851.1）、纳塔尔倒吊笔（Wrightia natalensis AML76886.1）、马利筋（Asclepias curassavica AML76817.1）的FKF1一致性较高，达92.59%（图2B）。

Figure 1.  PCR amplification of LgFKF1 in L. gratissima

Figure 2.  Sequence of nucleotide and amino acid, and homologous alignment of amino acid sequences

在线工具ProtParam蛋白理化性分析表明：蛋白质分子式为C₃₁₀₁H₄₈₈₉N₈₈₁O₉₄₂S₂₈，相对分子量为70.483 kD，等电点（pI）5.63，不稳定指数为49.94，推测属于不稳定蛋白，酸性氨基酸残基总数（Asp+Glu）为84，碱性氨基酸残基总数（Arg+Lys）为69，平均亲水系数（GRAVY）为−0.294，脂肪系数为83.97。

LgFKF1蛋白通过软件SOPMA分析二级结构组成表明：二级结构由45.92%的无规则卷曲结构、24.29%的α螺旋结构、23.04%的扩展长链和6.74%的β-转角构成（图3A）；软件SWISS-MODEL蛋白的三维预测建模发现：三级结构由α螺旋、扩展长链和无规则卷曲构成（图3B），与二级结构预测的结果基本一致。SignalP4.1 Server预测表明：不存在信号肽。PROTTER预测表明：无跨膜结构区（图3C），说明该蛋白属于非分泌蛋白，在细胞质中合成后不被转运；软件ProtScale预测蛋白亲/疏水性结果表明：蛋白亲水性氨基酸均占65%，疏水性氨基酸均占35%（图4），由此说明，亲水区域分布面积较广，所占比例较高；疏水区域分布面积较少，所占的比例较低，因此，推测LgFKF1蛋白为亲水性蛋白。在线软件ProtComp9.0预测亚细胞定位在细胞核中的可能性最大，为9.92。蛋白系统进化分析（图5)表明：LgFKF1蛋白与扁果树（Kaliphora madagascariensis AML77708.1）亲缘关系最近，软枝黄蝉（Allamanda cathartica AML77851.1）、纳塔尔倒吊笔（Wrightia natalensis AML76886.1）、马利筋（Asclepias curassavica AML76817.1）次之，与舞草（Codariocalyx motorius AML78631.1）、菜豆（Phaseolus vulgaris XP-007160435.1）最远。

Figure 3.  Prediction analysis of LgFKF1 protein sequence

Figure 4.  Bioinformatic prediction for hydrophily/hydrophobicity of LgFKF1 protein

Figure 5.  Phylogenetic tree of LgFKF1 protein

在短日照诱导光周期处理7 d时，LgFKF1较长日照非诱导光周期的表达量高，之后，在处理10、13、19 d的表达量均低于长日照的表达量，并且在成花形态发生明显转变时（即花序原基分化期，短日照处理13 d）表达量达最低（图6）。由此说明，LgFKF1在成花转变状态下呈下调表达，这与转录组测序的结果一致。

Figure 6.  Expression of LgFKF1 under different photoperiods

一天24 h中，LgFKF1基因在各组织中的表达分析(图7）表明：在根中，14:00为一天中表达量最低点，之后逐渐升高，并于23:00达到最高峰，随后又波动降低；在茎中，8:00为一天中表达量最低点，随后逐渐升高，并于20:00达到第1个高峰后又逐渐降低直至2:00，之后又开始升高，并于5:00达到与第一个峰值相当的第2个高峰，随后又降低进入下一轮循环；在叶中，8:00 为一天中表达最高峰，11:00为一天中表达的最低峰，之后在14:00回升后又逐渐降低直至23:00，随后又在2:00升高达到第二个高峰后再次降低进入下一轮循环；在顶芽中，8:00为一天中表达最低点，之后逐渐升高，直至23:00达到最高峰，随后逐渐降低进入下轮循环；在着色期和露白期花蕾中，表达规律基本一致，即11:00为一天中表达最低点，之后逐渐升高，直至23:00达到一天中最高峰后又逐渐降低进入下轮循环；在开放花朵中，14:00为表达最低点，之后逐渐升高，直至23:00后小幅度降低后又在5:00升高到一天中的最高峰，随后降低进入下轮循环。总体看，LgFKF1一天24 h内在各组织中在20:00—5:00期间的表达量较高，而在11:00—14:00期间的表达量较低。从各组织的平均表达情况看，平均表达量由高到低的顺序依次为：叶>开放花朵>着色期花蕾>顶芽>露白期花蕾>茎>根。

Figure 7.  Spatio-temporal expression of LgFKF1

本研究中，同源性比对结果显示，LgFKF1与扁果树、软枝黄蝉、纳塔尔倒吊笔、马利筋的FKF1具有较高的同源性，而与研究成熟的拟南芥、水稻等草本模式植物的FKF1比对则没有达到较高的同源性。然而，与LgFKF1同源性较高的这些物种的FKF1生物学功能研究目前未见报道。因此，推测LgFKF1由于序列结构有别于草本模式植物，其功能也可能与草本模式植物存在差异。另外，生物信息学分析表明，LgFKF1蛋白具有不含信号肽，无跨膜结构，属于非分泌型亲水蛋白，亚细胞预测定位在细胞核，符合拟南芥^[14]、大豆^[10]FKF1蛋白的特征，满足FKF1基因发挥转录调控作用的要求。

在拟南芥中，AtFKF1在长日照下促进开花，短日照下开花表型不明显^[4-5]；而大豆GmFKF1转基因植株在长日照下大部分稍微晚花，而过表达植株在短日照下有50%以上表现为极早花^[10]。在本研究中，相对于非诱导光周期，LgFKF1在诱导光周期下除了在较短时间处理上上调表达外，随处理时间延长均下调表达。由此暗示，馥郁滇丁香LgFKF1在成花状态下处于下调表达，其功能可能与拟南芥、大豆的FKF1有所不同，值得进一步进行功能验证。

不同植物的FKF1同源基因节律表达规律不尽相同。在拟南芥中，AtFKF1在长日照下表达峰值出现在早上10:00，在短日照下表达峰值出现在早上7:00^[15]；大豆GmFKF1的表达在短日照下仅在早上10：00达到峰值，在长日照下仅在早上12:00达到峰值^[10]；短日照洋葱（Allium cepa）品种中，AcFKF1在长日照和短日照下的表达都出现在早上7:00—8:00^[16]。研究表明，FKF1在许多组织中均有表达，而以叶片中的表达量最高^[17]。本研究中，LgFKF1除叶片中在早上8:00的表达峰值出现在白昼中，其余各组织中的表达峰值均出现在夜间，并且一些组织中还出现表达双峰值，这与报道的草本植物存在差异。由此推测，馥郁滇丁香LgFKF1基因在成花调控中可能具有特异的生物学功能。

从馥郁滇丁香中克隆获得了FKF1同源基因LgFKF1，该基因编码长度为638 aa的蛋白质，具有不含信号肽、无跨膜结构、属于非分泌型亲水蛋白以及亚细胞预测定位在细胞核等特征。随诱导光周期处理时间延长，LgFKF1相对于非诱导光周期呈下调表达；在诱导光周期下，根、芽及花蕾中出现单峰表达，而茎、叶及开放的花朵中出现双峰表达；除早上8:00叶片中的表达峰值出现在白昼，其余各组织中的表达峰值均出现夜间；一天中，叶片中的表达量最高。本研究为LgFKF1基因生物功能的进一步研究提供参考依据。