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昆虫的化学感受系统在其生存和繁殖过程中起着极其重要的作用[1-3]。在过去10多年的时间里，研究者对昆虫触角嗅觉信号传导的分子机制研究有了突出的进步。在昆虫嗅觉识别时，气味分子从触角感器孔渗入，然后被气味结合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）或化学感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）识别和转移，最后激活位于嗅觉感觉神经元（olfactory sensory neurons，OSNs）树突膜上的嗅觉受体（odorant receptors，ORs）或离子型受体（ionotropic receptors，IRs），产生电位，指导昆虫做出相应的行为反应[4-8]。此外，还有一些蛋白如感觉神经元膜蛋白（sensory neuron membrane proteins，SNMPs）在昆虫气味识别过程中也扮演着至关重要的作用[5]。
昆虫SNMPs也是一种膜蛋白，与脊椎动物CD36家族为同源基因，具有2个跨膜区域，其功能主要是识别和转运亲脂性气味分子如脂肪酸和脂类化合物等[9-14]。昆虫第一个SNMP基因在多音天蚕（Antheraea polyphemus Cramer）中被鉴定，并命名为ApolSNMP1[9]。随后在烟草天蛾（Manduca sexta L.）中发现SNMP的第二个亚类型，即命名为MsexSNMP2[10, 15]。紧接着SNMP的同源基因在鳞翅目Lepidoptera[10, 15-16]、双翅目Diptera[17]、鞘翅目Coleoptera[18]、直翅目Orthoptera[13]和膜翅目Hymenoptera[19]等昆虫中都有发现。一直以来被认为SNMP基因家族就2个成员，即SNMP1和SNMP2。最近昆虫SNMP家族的第三个成员SNMP3在鳞翅目中被鉴定[20-21]，但认为该基因的主要功能与昆虫的免疫反应有关，这还需要进一步的去证明。
红脊长蝽（Tropidothorax elegans Distant）属半翅目（Hemiptera）长蝽科（Lygaeidae），主要为害刺槐（Robinia pseudoacacia L.）、辣椒（Capsicum annuum L.）、葫芦（Lagenaria siceraria Molina）、油菜（Brassica napus L.）、大白菜（Brassica pekinensis Lour.）和小麦（Triticum aestivum L.）等多种植物，食性较杂。关于红脊长蝽的嗅觉基因研究较少，本研究通过前期红脊长蝽触角转录组测序结果[22]，鉴定了红脊长蝽的2个SNMP基因，即TeleSNMP1和TeleSNMP2，并通过荧光定量PCR技术对红脊长蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2在不同组织中的表达情况进行分析，为进一步探索红脊长蝽SNMPs的化学通讯功能奠定基础。
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红脊长蝽来自河南科技大学林学院昆虫实验室，该群体为自2014年7月在洛阳周边（112˚26′ E，34˚43′ N）蔬菜地采集的成虫，然后在温室内继代饲养至今。温室条件为：温度25 ± 2℃，相对湿度60% ± 5%，光周期14L∶10D。
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选取红脊长蝽羽化后第3 d的雌雄成虫，收集触角各100头、头部各30头、胸部各20头、腹部各5头、足各50头、翅各50头，每个样品收集材料重复3次。将红脊长蝽各部分组织解剖后立即放入浸在液氮中的1.5 mL离心管内，然后保存于−80℃中。
总RNA的提取采用RNAiso Plus Kit（TaKaRa，北京）试剂盒进行，并使用RNase-free DNase I（TaKaRa，北京）对提取的RNA进行除DNA处理。采用1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000c分光光度计（Thermo Scientific）进行质量检测。采用PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，北京）试剂盒对RNA进行反转录。
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从本实验室前期对红脊长蝽触角转录组测序注释结果中[21]搜素到2个SNMP基因。根据该序列设计特异性引物，TeleSNMP1-F：5′-ATGGCTGCACCACTGAGG-3′，TeleSNMP1-R：5′- CTAGTACTTTGCCGGGGGTG-3′；TeleSNMP2-F：5′-ATGACGAAGGTGCTGTTCCC-3′，TeleSNMP2-R：5′-TTAGCTTGTGAGAGTCCTTTTGA-3′，进行PCR扩增。PCR反应体系为20 μL：雌蛾触角cDNA模板1 μL，上下游引物各1.5 μL（10 μmol·L−1），dNTPs混合液1.6 μL（2.5 μmol·L−1），Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL（TaKaRa，大连），10 × Ex Taq buffer 2 μL，ddH2O为12.2 μL。PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；最后72℃ 10 min。胶回收目的片段，将目的片段克隆到pMDTM19-T载体上，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆培养过夜，送去测序。
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核酸序列采用在线工具（
http://www.bio-soft.net/sms/ ）翻译；采用（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM ）在线工具进行跨膜区域预测；利用在线工具（https://web.expasy.org/protparam/ ）对蛋白序列特性进行分析；蛋白亲疏水性采用在线工具（https://web.expasy.org/protscale/ ）分析；序列比对采用线下DNAMAN进行多重序列比较；进化树采用线下MEGA 6.0构建。 -
通过荧光定量PCR检测红脊长蝽SNMPs基因在不同组织中的表达情况。根据红脊长蝽SNMPs基因的开放阅读框和荧光定量引物设计原则设计特异性引物，TeleSNMP1-F：TCACCATCCCTCATCCA，TeleSNMP1-R：TCTTCGCCGTCTTTCAT，TeleSNMP2-F：TGTGGGAACGGAACTCT，TeleSNMP2-R：GCACCTTGGCACTTTG。内参基因为红脊长蝽Actin基因（基因登陆号为MG322127），引物为：TeleActin-F：CAAGGACGAAACAATCA；TeleActin-R：GAGAATACACTCCCAGAAC。
荧光定量PCR被执行在ABI 7500 PCR仪（ABI，Carlsbad，CA，USA）上进行，每个反应体积20 μL，包括10 μL的2 × SYBR Green PCR Master Mix（TaKaRa，大连）、0.8 μL的正反向引物（10 μmol·L−1）、2 μL的cDNA模板（200 ng）和6.4 μL的DEPC水。PCR循环遵循95℃ 30 s，然后95℃ 5 s，53℃ 31 s，共循环40个周期。试验重复3次。
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红脊长蝽SNMPs基因在不同组织中的相对表达量采用公式2−∆∆CT[23]计算。利用SPSS 17.0软件中的ANOVA方法对TeleSNMPs在红脊长蝽不同组织中的表达量进行显著性差异比较（新复极差法检验，P ≤ 0.05）。
1.1. 试虫的准备
1.2. 总RNA的提取与第一链cDNA的合成
1.3. 红脊长蝽SNMPs基因的克隆
1.4. 红脊长蝽SNMPs基因的序列分析
1.5. 实时定量PCR
1.6. 数据分析
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将测序结果在NCBI上进行同源性搜索，结果表明所测序列与多种昆虫的SNMP基因序列高度同源，证明这2个基因就是红脊长蝽的SNMP基因，并分别命名为TeleSNMP1和TeleSNMP2，在NCBI基因登陆号分别为MW442946和MW442947。
这2个SNMPs基因都具有全长的开放阅读框，TeleSNMP1长度为1 497 bp，编码498个氨基酸（图1）；而TeleSNMP2长度为1 686 bp，编码561个氨基酸。这2个基因都是酸性，TeleSNMP1的等电点是8.26，蛋白分子量是55.59 kD；TeleSNMP2的等电点是7.05，蛋白分子量是63.37 kD。
TeleSNMP1和TeleSNMP2在氨基酸序列的N-端和C-端各有一个跨膜区域，其中TeleSNMP2在氨基酸第158和180之间还有一个跨膜区域。在膜外区域6个保守的半胱氨酸残基位点被预测（图1），这6个保守的半胱氨酸位点与CD36基因家族相似。
Figure 1. Alignment of Tropidothorax elegans SNMP1 and SNMP2 with SNMPs from other insects
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将红脊长蝽TeleSNMP基因与已报道的其他昆虫SNMP基因的氨基酸序列在NCBI中的Blastp在线搜索工具进行同源性分析，发现TeleSNMP基因与不同种类昆虫SNMP基因一致性差别较大。与同目昆虫SNMP基因一致性较高，如TeleSNMP1与茶翅蝽 (Halyomorpha halys Stal) HhalSNMP1序列一致性在81.33%；与苜蓿盲蝽 (Adelphocoris lineolatus Goeze) AlinSNMP1序列一致性在68.54%；与不同目昆虫SNMP基因一致性较低，如TeleSNMP1与斑痣悬茧蜂 (Meteorus pulchricornis Wesmael) MpulSNMP1序列一致性在43.44%。但TeleSNMP2与所有昆虫SNMP基因一致性都不高，如与茶翅蝽HhalSNMP2序列一致性在48.68%；与苜蓿盲蝽AlinSNMP2序列一致性在41.18%；与德国小蠊 (Blattella germanica Linnaeus) BgerSNMP1序列一致性在46.22%。TeleSNMP2与玉带凤蝶 (Papilio polytes L.) PpolSNMP2序列一致性在30.94%；与亚洲小车蝗 (Oedaleus asiaticus Bei-Bienko) OasiSNMP2序列一致性在34.76%。红脊长蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2之间序列一致性仅有29.66%。
使用MEGA6.0对9个目的36种昆虫SNMP同源基因进行进化树比较。SNMPs基因被分成2个亚组，即SNMP1和SNMP2（图2），每亚组中同目昆虫SNMP基因同源性最高。红脊长蝽的TeleSNMP1和TeleSNMP2基因分别被集聚到这2个亚组，并且与同为半翅目昆虫的苜蓿盲蝽、茶翅蝽和黑肩绿盲蝽SNMP基因进化关系最近，与其他目昆虫SNMP关系较远。
Figure 2. Phylogenetic tree of the SNMPs of Tropidothorax elegans and other insects based on amino acid sequences by using neighbor-joining method
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使用荧光定量PCR对红脊长蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2在不同组织中的表达情况进行分析，结果发现：TeleSNMP1和TeleSNMP2在雌雄蛾触角中高度表达，TeleSNMP1在雄蛾触角中的表达量明显高于雌蛾，TeleSNMP2的表达情况刚好相反，即TeleSNMP2在雌蛾触角中的表达量明显高于雄蛾。除触角外，TeleSNMP1几乎不在其他组织中表达或表达量甚微。TeleSNMP2除在触角中表达量丰富外，在足和翅中也有少量表达（图3）。
Figure 3. Expression level of SNMPs in different tissues of Tropidothorax elegans
2.1. 红脊长蝽SNMPs基因克隆及序列分析
2.2. 红脊长蝽SNMPs与其他昆虫SNMP基因的同源性及进化树分析
2.3. 红脊长蝽SNMPs基因表达谱分析
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本研究根据前期红脊长蝽触角转录组的数据，通过BLASTX在线搜索和同源性比较鉴定出2个SNMPs基因，即TeleSNMP1和TeleSNMP2。这2个基因与其他昆虫SNMPs具有类似的特征，如在氨基酸序列N端和C端附近有2个保守的跨膜区域，并且由6个保守的半胱氨酸残基形成二硫键组成一个大的胞外环，此结构也与CD36基因家族极其相似[24-26]。根据对这2个跨膜蛋白结构投影预测，这部分的功能是转运和结合脂类分子[27-28]，我们可推测红脊长蝽SNMPs的2个跨膜区具有同样的功能。但红脊长蝽TeleSNMP2在氨基酸序列第158和180之间多了1个跨膜区域，目前关于SNMPs基因具有3个跨膜区域的报道还没有，可能是鉴定的SNMPs数量还不够庞大，也可能长期进化形成的。
红脊长蝽TeleSNMP基因同源性搜索发现TeleSNMP基因与不同种类昆虫SNMP基因一致性差别较大。与同目昆虫SNMP基因一致性较高，与不同目昆虫SNMP基因一致性较低。红脊长蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2之间分歧也比较大。进化树结果也显示，红脊长蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2分别被集聚到SNMP1和SNMP2两个亚组，在同一组内同目昆虫的SNMP基因进化关系最近，与其他目昆虫SNMP关系较远。此结果与大多数昆虫SNMP基因特性相同[26,29-30]。在鳞翅目中曾经鉴定出SNMP3亚家族基因[20]，而在红脊长蝽触角转录组数据中没有发现该基因，可能是这个基因在幼虫肠中高度表达的原因。
组织特异性表达可以为功能预测提供可靠性的参考。我们研究发现红脊长蝽SNMP1主要表达在雌雄蛾的触角中，此结果与多音蚕蛾[9]、脐橙螟（Amyelois transitella Walker）[31]、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Htibner）[32]和中红侧沟茧蜂（Microplitis mediator Haliday）[33]等多种昆虫SNMP1的表达模式相同。Benton等[34]在果腹黑蝇（Drosophila melanogaster wDm）中发现，DmelSNMP1能够识别集合信息素cVA，激活受体HR13。Pregitzer等[28]在烟芽夜蛾（Heliothis virescens Fabricius）中也发现，HvirSNMP1能明显增强HR13对信息素Z11-16:Ald的结合力。以上研究都暗示昆虫SNMP1的功能是调节信息素的识别和通过SNMP-OR互作转运信息素。相对于TeleSNMP1，TeleSNMP2的表达相对广泛，除嗅觉感器触角外，在非嗅觉感器足中也有少量表达，此结果与小菜蛾（Plutella xylostella L.）[35]、二化螟（Chilo suppressalis Walker）[36]、稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis G.）[37]、甜菜夜蛾[31]和中红侧沟茧蜂[32]一致。昆虫身体上分布有大量的味觉感器[38]，而CD36蛋白的主要功能是转运脂类化合物，因此可推测TeleSNMP2和GRs在这些组织中共同表达，识别脂类分子完成味觉过程。
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本研究首次克隆和鉴定了红脊长蝽的2个SNMPs基因，即TeleSNMP1和TeleSNMP2。同目昆虫同类SNMP同源序列一致性较高，反之，不同目昆虫不同类SNMP同源序列一致性较低。同样，TeleSNMP1和TeleSNMP2之间的序列一致性也极低。TeleSNMP1主要在雌雄触角中特异性表达，而TeleSNMP2除触角外，在非触角组织中也有表达。
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