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随着农业生产化肥使用的增加和化石燃料燃烧等人类活动的加剧,使通过大气进入陆地生态系统的氮(N)不断增加[1-2],已严重影响陆地生态系统碳(C)循环等关键生态学过程[1-4]。森林土壤C库是陆地生态系统土壤C库的主体(占70%),在缓解全球气候变化中发挥重要作用[5-6]。因此,森林土壤有机碳(SOC)库如何响应N沉降这一问题引起研究人员的极大关注[6-9]。研究表明,SOC对N沉降的响应主要表现为增加、降低和无影响[8-11]。大量研究结果表明,N沉降能增加土壤N的有效性,提高植物的生产力和通过凋落物、细根向土壤输入的碳,进而增加SOC积累[6, 10];也有研究表明,N沉降通过抑制SOC的分解来增加土壤碳,如N沉降能降低木质素真菌的丰度和木质素降解细胞外酶活性,进而降低SOC分解速率[8, 10-11]。另有研究表明,土壤pH值在影响微生物生物量和土壤碳周转方面起着主要作用,较低pH值能抑制微生物活性,进而降低SOC分解[12-13]。然而,可溶性有机碳(DOC)作为碳循环中的重要组成部分[14],在SOC形成中起着重要作用,但在N沉降背景下,DOC在SOC吸存中的作用尚不清楚。
土壤微生物参与了土壤大部分的生物地球化学循环过程,在森林生态系统碳氮循环过程中起关键作用[5, 14]。研究表明,N沉降能改变土壤微生物群落结构[15-16]。由于细菌比真菌更喜欢利用碳氮比(C/N)较低的C源,N沉降降低土壤C/N,有利于土壤细菌生长[17]。Meta分析结果也表明,N增加显著降低微生物生物量、细菌、真菌生物量和微生物呼吸[18]。Wu等[19]研究发现,经过8 a N沉降试验后,土壤严重酸化,植被物种丰富度降低,进而导致丛枝真菌微生物量含量下降,细菌生存胁迫指数增加。然而,这些研究结果主要来自温带地区,与温带地区不同,亚热带森林土壤N相对饱和[20]。因此,N沉降的增加对微生物及其群落结构的影响及其机制可能与温带不同。
有关亚热带森林生态系统对N沉降的响应已有许多研究,但这些研究主要集中在亚热带人工林中[21-22],而针对亚热带顶级群落的常绿阔叶天然林的相关研究仍较少[8]。我国亚热带地区生物多样性高、生产力高,是我国重要的森林碳汇基地,而米槠(Castanopsis carlesii (Hemsl.) Hayata.)是本区域地带性顶级群落主要树种之一。本研究通过野外模拟不同N沉降水平,探讨土壤有机碳含量和可溶性有机碳以及微生物群落结构的变化,以便能够更准确地理解N沉降对亚热带常绿阔叶林生态系统碳汇功能的影响,为预测未来森林生态系统对全球变化的响应与适应提供实地观测数据和理论基础。
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2011年6月,在米槠天然林内设置12个20 m × 20 m样地,相邻2个样地间隔10 m作为缓冲区。试验采用随机区组设计,设置对照(CK,0 kg·hm−2·a−1)、低氮(LN,40 kg·hm−2·a−1)、高氮(HN,80 kg·hm−2·a−1)3种处理(2011年N沉降背景值36 kg·hm−2·a−1),每处理4个重复,N沉降量分每月等量(全年分12次)喷洒至相应样地。每月月初将硝酸铵(NH4NO3)溶于20 L蒸馏水,利用喷雾器均匀喷洒至相应样方内,对照处理喷洒等量蒸馏水,减少因外加水造成的森林生物地球化学循环的影响。N沉降于2012年10月开始实施。
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2016年7月,利用直径2 cm土钻在各处理样地中采集0~10、10~20 cm土样。在每个样地内选择10个点采集土壤样品混合成一个样品,放在冰袋中立即带回实验室。然后,去除动植物残体、小石子等杂质并过2 mm筛。样品分为2部分,一部分−20℃冷藏用于分析土壤微生物生物量,另一部分风干用于土壤理化性质的分析。
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土壤总有机碳(SOC)、总氮(TN)使用元素分析仪直接测定(Elementar Analyzer Vario EL IV,德国)。用去离子水按照水土比4:1提取土壤可溶性有机碳(DOC),混合液放入震荡仪震荡30 min(7 g),然后放入高速离心机内离心15 min(1 370 g),最后提取上层清液并过0.45 μm滤膜,滤液利用总有机碳分析仪(TOC-VCPH/CPN,Shimaszu,日本)测定DOC含量。土壤硝态氮(NO3−-N)、铵态氮(NH4+-N)使用氯化钾(KCl)按水土比4:1提取,采用连续流动分析仪(Skalar san++,荷兰)测定。土壤pH值使用去离子水按水土比2.5:1提取,搅拌后静置等溶液澄清后,采用玻璃电极测定(STARTER 300,OHAUS,美国)。
土壤微生物群落结构采用磷脂脂肪酸(PLFAs)法测定[16],称4 g鲜土,经过脂类抽提、脂类分离、甲脂化后,所得溶液采用气相色谱仪(Agilent 6890 N,美国)测定,同时结合MIDI微生物识别系统(MIDI, Inc., New-ark,DE),根据各脂肪酸组分峰值保留时间确定微生物种类,微生物PLFA表征[23]见表1。
微生物类型
Microbial group磷脂脂肪酸标记
Phospholipids fatty acid signatures革兰氏阳性细菌
Gram-positive bacteria, GPi14:0、i15:0、i16:0、i17:0、a15:0、a17:0 革兰氏阴性细菌
Gram-negative bacteria, GN16:1ω9c、16:1ω7c、18:1ω7c、18:1ω5c、cy17:0、cy19:0ω8c 真菌
Fungi18:1ω9c、18:2ω6c 丛枝菌根真菌
Arbuscular mycorrhizae fungi, AMF16:1ω5c 放线菌
Actionmycetes, ACT10Me 16:0、10Me 17:0、10Me 18:0 Table 1. PLFAs characterizing microbes
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对所有的数据进行正态性检验(Shapiro-Wilk检验),有必要时对数据进行对数转换。对不同处理之间土壤基本理化性质和各类微生物生物量的差异显著性进行多重比较(LSD检验)。运用混合线性模型评估N沉降和土层对土壤基本理化性质和各类微生物生物量的影响,N处理和土层作为固定因子,区组作为随机因子,显著性水平设定为p < 0.05,混合线性模型采用R包nlme。用Pearson相关系数分析在N沉降水平下不同土层土壤理化性质和各类微生物生物量及总微生物生物量的相关性;采用主成分分析(PCA)法分析微生物群落结构差异性;采用随机森林模型计算土壤理化性质和微生物对土壤有机碳影响的相对重要性,使用R包RandomForest进行随机森林计算,利用R包rfPermute检测各影响因素重要性的p值。所有统计分析均在R (R.3.6.1)软件中完成。
2.1. 试验设计
2.2. 土壤采集与处理
2.3. 土壤理化性质及微生物测定
2.4. 数据统计与分析
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0~10 cm土层中,与CK相比,LN处理显著提高了SOC、TN、NO3−-N、DOC含量和C/N,而土壤pH值和NH4+-N含量无显著变化;HN处理土壤pH值显著增加,NO3−-N含量增加约1倍,而对SOC、TN、DOC、NH4+-N含量和C/N比无显著影响(表2)。
土层
Soil layer/cm处理
Treatment土壤有机碳
SOC/(g·kg−1)总氮
TN/(g·kg−1)碳氮比
C/N ratio可溶性有机碳
DOC/(mg·kg−1)pH值
pH铵态氮
NH4+-N/
(mg·kg−1)硝态氮
NO3−-N/
(mg·kg−1)0~10 HN 27.7 ± 1.9 A 1.90 ± 0.05 A 14.5 ± 0.56 A 140 ± 5 A 4.15 ± 0.12 B 33.1 ± 4.9 A 6.1 ± 1.7 A LN 36.7 ± 1.4 B 2.20 ± 0.04 B 16.8 ± 0.39 B 192 ± 1 B 4.01 ± 0.03 A 28.2 ± 3.1 A 6.7 ± 0.6 A CK 28.8 ± 0.82 A 1.87 ± 0.02 A 15.4 ± 0.23 A 127 ± 16 A 4.05 ± 0.02 A 29.3 ± 2.3 A 3.1 ± 0.6 B 10~20 HN 13.7 ± 1.1 A 1.10 ± 0.02 A 12.4 ± 0.75 A 20.4 ± 1.6 A 4.25 ± 0.02 B 23.4 ± 1.5 A 5.3 ± 1.0 A LN 13.8 ± 0.39 A 1.06 ± 0.03 A 13.0 ± 0.41 A 24.8 ± 2.1 B 4.23 ± 0.03 B 20.1 ± 1.0 AB 5.8 ± 1.2 A CK 12.6 ± 0.77 A 1.07 ± 0.04 A 11.8 ± 0.33 A 25.3 ± 0.25 B 4.34 ± 0.05 A 15.7 ± 1.3 B 6.9 ± 0.8 A p value N 0.04 0.99 0.17 0.04 0.007 0.95 0.02 D < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.001 0.03 N × D 0.55 0.85 0.18 0.46 0.007 0.43 0.03 注:不同大写字母表示同一土层不同处理间差异显著(p < 0.05)。N:氮沉降;D:土层;
Notes: Different capital letters indicate statistical significance in the same soil layer at p = 0.05. N, Nitrogen deposition; D, Soil depth.Table 2. Changes of soil properties under different nitrogen level addition treatments in different layer
10~20 cm土层中,与CK相比,LN处理土壤pH值显著降低,而其他理化性质均无显著变化;HN处理后土壤NH4+-N含量显著增加,而pH值和DOC含量显著降低,其他理化性质无显著变化(表2)。
混合线性模型分析结果(表2)表明:N沉降对SOC、DOC、NO3−-N和pH均有显著影响,而土层对各个土壤理化性质参数均有显著影响;此外,NO3−-N和pH受N沉降和土层交互作用的影响,而对其它理化性质不存在交互作用。
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图1表明:0~10、10~20 cm土层中,不同N沉降水平处理下,土壤细菌PLFAs含量显著大于真菌和放线菌PLFAs含量。不同N沉降水平对同一土层中不同类群微生物PLFAs含量的影响不同;同时,土层深度也是影响各类群微生物PLFAs含量的一个重要因素。
Figure 1. PLFAs concentration of soil microbial groups in different N level addition treatments in different layer
0~10 cm土层中,与CK相比,LN处理的总PLFAs以及革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、丛枝菌根真菌、放线菌、真菌和细菌的PLFAs含量分别增加25.4%、27.5%、24.9%、29.1%、26.3%、22.4%、26.2%,而对GP/GN和F/B无显著影响,HN处理与LN处理的结果类似(图1)。10~20 cm土层中,与CK相比,LN处理革兰氏阳性菌的PLFAs含量降低18.3%,而对其它微生物类群、GP/GN和F/B均无显著影响,HN处理对各类微生物及总PLFAs含量均无显著影响(图1)。
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主成分分析结果(图2)表明:前2个主成分解释了微生物群落结构的84.9%,其中,主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的解释度分别为74.9%和10.0%。N沉降显著影响0~10 cm土壤微生物群落结构,而对10~20 cm土层土壤微生物群落结构无影响。此外,0~10、10~20 cm土层间土壤微生物群落结构差异显著,并且与是否N沉降处理无关。
Figure 2. Principal component analysis of PLFAs composition of microbial community under different nitrogen level addition treatments
Person相关性分析(表3)发现:在0~10 cm土层中,除革兰氏阳性菌外,其余各类微生物类型及总PLFAs含量与SOC、TN呈显著或极显著正相关;土壤DOC与除放线菌外的其他各类微生物类型的PLFAs含量均呈显著正相关;土壤真菌PLFAs含量与C/N呈显著正相关。与0~10 cm相比,10~20 cm土层中各菌群PLFAs含量与氨氮、硝氮、SOC、TN、pH以及DOC含量无明显相关性。
土层
Soil layer/cm微生物类型
Microbial group铵态氮
NH4+-N硝态氮
NO3−-N土壤有机碳
SOC总氮
TN碳氮比
C/N ratiopH值
pH可溶性有机碳
DOC0~10 革兰氏阳性细菌 GP −0.033 0.479 0.531 0.651* 0.336 −0.212 0.580* 革兰氏阴性细菌 GN −0.101 0.561 0.655* 0.762** 0.475 −0.356 0.629* 细菌 Bacteria −0.059 0.514 0.582* 0.699* 0.392 −0.269 0.604* 放线菌 ACT −0.158 0.55 0.599* 0.688* 0.435 −0.34 0.565 真菌 Fungi −0.046 0.4 0.724** 0.773** 0.611* −0.326 0.589* 总 PLFAs −0.079 0.53 0.642* 0.748** 0.458 −0.307 0.627* 10~20 革兰氏阳性细菌 GP 0.113 0.066 −0.095 0.205 −0.287 0.528 −0.422 革兰氏阴性细菌 GN 0.232 −0.031 −0.128 0.236 −0.344 0.352 −0.261 细菌 Bacteria 0.176 0.022 −0.116 0.23 −0.329 0.469 −0.366 放线菌 ACT 0.026 −0.072 0.02 0.346 −0.214 0.477 −0.014 真菌 Fungi 0.133 −0.143 −0.051 0.32 −0.292 0.139 −0.094 总 PLFAs 0.149 −0.02 −0.085 0.281 −0.319 0.45 −0.274 注Note:**p < 0.01, *p < 0.05. Table 3. Correlations between soil PLFA content and soil physical and chemical indicators
随机森林模型结果(图3)表明:DOC、TN、C/N、总PLFAs、细菌、丛枝菌根真菌和放线菌是驱动SOC变化的主要因素,随机森林模型能解释SOC变化的93%(p < 0.001)。