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化石燃料与化学N肥大量施用引起的N沉降现象已成为不容忽视的全球变化问题之一[1]。N沉降的急剧增加,直接威胁着水域生态系统和陆地生态系统的平衡[2],而森林生态系统作为陆地生态系统的主体,以其复杂的组成与结构,不可避免地受全球气候变化的影响。森林土壤作为森林生态系统的主要C库、N库[3],约将N沉降中2/3固定在土壤有机质中[4]。其中,土壤酶作为森林土壤生态系统的组成部分,其活性高低在很大程度上反映了物质循环的快慢[5],并在一定程度上反映了森林土壤状况,包括有机质的分解能力和简单物质的再合成能力[6]。为研究N添加对土壤酶活性的影响,可将其分为两大类:(1) 负责获得C、N、P以维持初级代谢的水解酶,包括蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、β-葡萄糖苷酶等;(2) 负责降解复杂化合物以提供营养物质的氧化还原酶,包括过氧化氢酶、过氧化物酶和酚氧化酶等[7]。这些土壤酶可能对N添加有不同的反应,而研究更多种类的土壤酶有助于我们更全面的了解N添加后土壤有机质的周转过程。
N沉降对不同森林生态系统下土壤酶活性存在促进、抑制和无影响3种影响,主要原因在于森林中的土壤理化性质受气候、林地类型、林龄及模拟N沉降时间长短等多个因素共同作用[8-10]。目前关于N沉降下土壤酶活性的研究,土壤酶的种类较少,且多集中在同一林型[11],如张艺等[12]对北京市辽东栎(Quercus mongolica Fisch.ex Ledeb.)施N后,N沉降显著促进了土壤脲酶、酸性磷酸酶活性,对土壤过氧化氢酶和多酚氧化酶活性无显著差异;李吉玫等[13]对天山云杉林(Picea schrenkiana Fisch.et Mey.)进行模拟施N,结果表明N沉降显著抑制了过氧化物酶和多酚氧化酶活性,而对土壤脲酶活性有较小促进作用;Cusack等[7]对实验森林的研究表明,N沉降可提高热带山地森林土壤多酚氧化酶和过氧化物酶活性。但不同土壤酶活性对外源N添加如何响应,哪种酶活性对不同施N浓度的响应最为敏感仍具有不确定性。
滇中亚高山区域位于我国云贵高原、青藏高原和横断山地三大自然地理区域相结合的部位,植被以半湿性常绿阔叶林为主[14]。本研究选取国内外常用于研究模拟N沉降下土壤活动的8种代表性土壤酶[11-13, 15-18],以该地区不同森林生态系统云南松(Pinus yunnanensis Franch.)林、高山栎(Quercus semecarpifolia Smith)林、华山松(Pinus armandii Franch.)林和常绿阔叶(Evergreen broad-leaf)林为研究对象,分析林下不同土壤酶活性对不同N沉降的响应差异,旨在为研究N沉降对区域森林生态系统的土壤生态学过程及维护土壤生态系统的稳定性提供理论依据。
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在云南省新平县磨盘山森林生态系统国家定位观测研究站(23º46′18″~23º54′34″ N,101º16′06″~101º16′12″ E)设置试验样地。该地区属于中亚热带气候,年降水量1 050 mm,年平均气温15 ℃,极端最高气温为33.0 ℃,极端最低气温为−2.2 ℃。磨盘山海拔1 260.0~2 614.4 m,以第三纪古红土发育的山地红壤、玄武岩红壤和黄棕壤为主[19]。该区植被类型随海拔的升高呈明显的垂直分布特征,主要分布的森林类型为针叶林(华山松林、云南松林)、亚热带常绿阔叶林和高山矮林(高山栎林)等。
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2017年10月,在研究站内4种典型森林类型(云南松林、华山松林、常绿阔叶林和高山栎林)中(表1),设置3个20 m × 20 m的样地,在每个样地中随机设置4个3 m × 3 m的小样方,对应4种不同施N浓度,根据林地实际情况,将高浓度样地设置在下坡面,以尽量减小坡面径流泥沙引起的氮素迁移对土壤酶活性的影响。样方之间距离大于1 m,防止相互干扰。
森林类型
Forest type林分特征
Forest characteristics海拔
Altitude/m坡度
Slope/(°)平均胸径
Average DBH/cm平均树高
Average H/m郁闭度
Canopy density云南松林 Pinus yunnanensis forest 2 196 13 11.2 9.5 0.8 华山松林 Pinus armandii forest 2 151 19 11.8 10.4 0.7 常绿阔叶林 Evergreen broad-leaf forest 2 229 15 9.1 9 0.9 高山栎林 Quercus semicarpifolia forest 2 287 15 9.9 4.2 0.9 Table 1. Site characteristics of four forest types
本实验参考美国Harvard Forest模拟氮沉降和华西雨屏区模拟氮沉降等试验中的实验设置[14-17],结合我国西南地区,如四川盆地西缘[20]、昆明东郊[21]及西双版纳[22]等地的年N沉降量水平,以推测该地区未来可能的N沉降趋势。本实验设定N沉降处理分4个水平:对照(CK,0 g N·m−2·a−1)、低N(LN,5 g N·m−2·a−1)、中N(MN,15 g N·m−2·a−1)、高N(HN,30 g N·m−2·a−1),每个水平3个重复。将年施用量均分成12份,从2018年1月初开始,每月用不同浓度N对各样方进行定量模拟N沉降处理。方法为在750 mL去离子水中溶解各N浓度水平所需NH4NO3(相当于全年新增降水1.0 mm),用喷雾器在3个水平样方中来回均匀喷洒,为减少水分增加对土壤环境与土壤酶活性的影响,对照组同时段喷洒750 mL去离子水。
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于施N一年后(2019年1月)采集0~5、5~10和10~20 cm土壤样品,每个样方用随机数字定位法随机取3钻后混合,带回实验室,过2 mm筛,置于无菌袋中。用四分法将样品均分,分别进行保存:一份室温自然风干保存,用于天门冬酰胺酶、脲酶、蔗糖酶的测定;一份冷藏于4 ℃冰箱,用于磷酸酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶的测定;另一份冷冻于−40 ℃冰箱,用于蛋白酶、淀粉酶的测定。
土壤酶活性的测定:实验通过自主添加基质进行土壤培养,测定反应产物和消耗基质量来表示酶活性,为了排除土壤本身含有的基质成分影响,每个实验都设置无基质-纯水和无土壤两种对照,蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定;淀粉酶活性采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定;脲酶活性采用靛酚比色法测定;酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定;过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定;蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定;天门冬酰胺酶活性采用扩散法测定;多酚氧化酶采用碘量滴定法测定[6]。
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统计数据、绘制图表采用Microsoft Office Excel 2010。数据分析采用SPSS 23.0中,其中,单因素方差分析法(One-way ANOVA)用以分析不同林分间、不同土层间及不同N沉降处理间土壤酶活性差异特征;多因素方差分析法(Multivariate ANOVA)用以分析土壤深度、施N水平和森林类型对土壤酶活性的影响。显著性水平设定为ɑ = 0.05。
1.1. 研究区概况
1.2. 试验设计
1.3. 样品采集、处理与测定
1.4. 数据处理
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在土壤深度、施N水平和森林类型三者交互作用下,高山栎林CK处理下0~5 cm土层蔗糖酶活性最高(15.035 mg·g−1·24 h−1),华山松林CK处理下10~20 cm土层活性最低(0.878 mg·g−1·24 h−1)。常绿阔叶林、华山松林和云南松林下土壤蔗糖酶活性均表现为随土层深度增加逐渐降低(图1),3种林分不同土层平均值为0~5 cm (12.04~3.91 mg·g−1·24 h−1) > 5~10 cm (9.14~2.43 mg·g−1·24 h−1) > 10~20 cm (5.37~1.48 mg·g−1·24 h−1),降幅分别在64.7%~30.5%、75.2%~50.7%和70.4%~33.5%,其中华山松林0~5 cm土层降幅最高。高山栎林中除LN处理下随着土层深度增加呈现先增加后降低的趋势,HN下随着土层深度增加逐渐增加(增幅为10.8%),其他土层蔗糖酶活性均表现为随土层深度增加逐渐降低。华山松林土壤蔗糖酶活性低于高山栎林80.0%,变化范围为0.878~13.704 mg·g−1·24 h−1,且存在显著差异(P < 0.05)。在不同施N浓度下,常绿阔叶林土壤蔗糖酶活性在LN与HN下显著高于CK处理(P < 0.05);华山松林表现为先促进,后在HN抑制,林下土壤蔗糖酶活性在LN与MN显著高于CK处理(P < 0.05);高山栎林与云南松林表现为先抑制,后在HN促进,林下土壤蔗糖酶活性在LN、MN处理下显著低于CK处理(P < 0.05)。其中,高山栎林土壤蔗糖酶活性表现最高,总体平均值为:高山栎林(13.01 mg·g−1·24 h−1) > 云南松林(8.85 mg·g−1·24 h−1) > 常绿阔叶林(7.31 mg·g−1·24 h−1) > 华山松林(2.61 mg·g−1·24 h−1)。
Figure 1. Changes of soil invertase activities in different soil layers of four forest types under different N deposition
从图2可以看出,在土壤深度、施N水平和森林类型三者交互作用下,云南松林LN处理下0~5 cm土层淀粉酶活性最高(1.437 mg·g−1·24 h−1),云南松林MN处理下10~20 cm土层活性最低(0.103 mg·g−1·24 h−1)。常绿阔叶林、华山松林、云南松林、高山栎林土壤淀粉酶活性均表现为随土层深度增加逐渐降低,降幅分别在66.1%~22.1%、76.8%~21.7%、67.7%~21.5%和70.9%~21.9%,其中华山松林MN处理降幅最高,4种林分不同土层平均值为0~5 cm (0.91~0.40 mg·g−1·24 h−1) > 5~10 cm(0.71~0.33 mg·g−1·24 h−1) > 10~20 cm(0.52~0.22 mg·g−1·24 h−1),且存在显著差异(P < 0.05)。在不同施N浓度中,常绿阔叶林表现为先抑制,后在HN促进,林下土壤淀粉酶活性在LN、MN处理下显著低于CK处理(P < 0.05);华山松林也表现为先抑制,后促进,林下土壤淀粉酶活性在MN与HN处理下显著高于CK处理(P < 0.05);高山栎林表现为施氮则抑制,但随着土层深度的增加,HN处理抑制程度降低,林下土壤淀粉酶活性在LN、MN和HN处理下均低于CK处理;云南松林表现为先促进,后抑制,林下土壤淀粉酶活性在LN处理下显著高于CK处理(P < 0.05)。其中,云南松林表现最高,总体平均值为:云南松林(0.71 mg·g−1·24 h−1) > 高山栎林(0.52 mg·g−1·24 h−1) > 华山松林(0.39 mg·g−1·24 h−1) > 常绿阔叶林(0.32 mg·g−1·24 h−1)。
Figure 2. Changes of soil amylase activities in different soil layers of four forest types under different N deposition
图3表明,在土壤深度、施N水平和森林类型三者交互作用下,华山松林LN处理下0~5 cm土层脲酶活性最高(0.777 mg·g−1·24 h−1),高山栎林CK处理下10~20 cm土层活性最低(0.251 mg·g−1·24 h−1)。4种林分不同土层间脲酶活性差异不显著(P > 0.05),但各土层平均值表现为随土层深度增加逐渐降低,不同土层平均值为0~5 cm (0.62~0.50 mg·g−1·24 h−1) > 5~10 cm (0.61~0.45 mg·g−1·24 h−1) > 10~20 cm (0.58~0.37 mg·g−1·24 h−1)。在不同施N浓度中,除高山栎林外,3种林分土壤脲酶活性均表现为先增加后降低,但常绿阔叶林土壤脲酶活性在各处理下差异均不显著(P > 0.05),华山松林则在LN处理下显著高于CK处理(P < 0.05),高山栎林与云南松林在LN、MN和HN处理下均显著高于CK处理(P < 0.05),增幅分别在36.9%~86.7%和40.7%~62.2%。其中,华山松林表现最高,总体平均值为:华山松林(0.60 mg·g−1·24 h−1) >常绿阔叶林(0.51 mg·g−1·24 h−1) > 高山栎林(0.49 mg·g−1·24 h−1) > 云南松林(0.44 mg·g−1·24 h−1),华山松林土壤脲酶活性高于云南松林36.4%。
Figure 3. Changes of soil urease activities in different soil layers of four forest types under different N deposition
图4表明,在土壤深度、施N水平和森林类型三者交互作用下,华山松林LN处理下0~5 cm土层天门冬酰胺酶活性最高(0.434 mg·g−1·24 h−1),常绿阔叶林CK处理下10~20 cm土层活性最低(0.007 mg·g−1·24 h−1)。4种林分下土壤天门冬酰胺酶活性均表现为随土层深度增加逐渐降低,降幅分别在98.1%~48.3%、88.6%~30.7%、83.4%~37.3%和83.6%~55.8%,其中常绿阔叶林CK处理降幅最高,4种林分不同土层平均值为0~5 cm (0.36~0.19 mg·g−1·24 h−1) > 5~10 cm (0.17~0.06 mg·g−1·24 h−1) > 10~20 cm (0.09~0.05 mg·g−1·24 h−1),且存在显著差异(P < 0.05),其变化范围为0.007~0.434 mg·g−1·24 h−1。在不同施N浓度中,常绿阔叶林和华山松林土壤天门冬酰胺酶活性随着施N水平的增加均表现为先增加,后减少,高山栎林和云南松林则表现为先增加,后减少,再增加。4种林分在LN处理促进,其中华山松林在0~5 cm土层对比CK处理增幅最大,为75.8%。常绿阔叶林表现最高,总体平均值为:常绿阔叶林(0.20 mg·g−1·24 h−1) > 高山栎林(0.16 mg·g−1·24 h−1) > 华山松林(0.14 mg·g−1·24 h−1) > 云南松林(0.10 mg·g−1·24 h−1),常绿阔叶林土壤天门冬酰胺酶活性高于云南松林50.0%。
Figure 4. Changes of asparaginase activity in different soil layers of four forest types under different N deposition
图5表明,在土壤深度、施N水平和森林类型三者交互作用下,常绿阔叶林CK处理下0~5 cm土层酸性磷酸酶活性最高(2.879 mg·g−1·24 h−1),高山栎林LN处理下10~20 cm土层活性最低(1.372 mg·g−1·24 h−1)。酸性磷酸酶活性在4种林分中均表现为随土层深度增加逐渐降低,降幅分别在34.0%~5.6%、35.0%~13.6%、41.0%~10.9%、和40.2%~11.1%,其中高山栎林LN处理降幅最高,4种林分不同土层平均值为0~5 cm (2.47~2.14 mg·g−1·24 h−1) > 5~10 cm (2.23~1.74 mg·g−1·24 h−1) > 10~20 cm (1.92~1.54 mg·g−1·24 h−1),其变化范围为1.372~2.879 mg·g−1·24 h−1,且存在显著差异(P < 0.05)。在不同施N浓度中,4种林分土壤酸性磷酸酶活性在各处理下存在显著差异(P < 0.05)。其中常绿阔叶林在HN处理下受到抑制,降幅在15.1%~5.1%;华山松在HN处理下受到促进,增幅在1.9%~22.1%;高山栎林与云南松林LN处理在10~20 cm土壤酸性磷酸酶受到抑制,降幅为17.2%和11.8%,在其他土层则表现为促进作用,增幅为20.0%~20.7%和6.7%~9.3%。常绿阔叶林表现最高,总体平均值为:常绿阔叶林(2.21 mg·g−1·24 h−1) > 华山松林(2.04 mg·g−1·24 h−1) >高山栎林(1.96 mg·g−1·24 h−1) >云南松林(1.81 mg·g−1·24 h−1),常绿阔叶林土壤酸性磷酸酶活性高于云南松林22.1%。
Figure 5. Changes of soil acid phosphatase activity in different soil layers of four forest types under different N deposition
图6表明,在土壤深度、施N水平和森林类型三者交互作用下,高山栎林LN处理下0~5 cm土层蛋白酶活性最高(1.297 mg·g−1·24 h−1),云南松林MN处理下10~20 cm土层活性最低(0.625 mg·g−1·24 h−1)。除HN处理下的华山松林和高山栎林外,其他土层蛋白酶活性均表现为随土层深度增加逐渐降低,降幅分别在33.8%~22.8%、17.4%~13.4%、41.5%~3.2%、和27.3%~4.9%,其中高山栎林MN处理降幅最大,4种林分不同土层平均值为0~5 cm (1.21~0.85 mg·g−1·24 h−1) > 5~10 cm (1.14~0.80 mg·g−1·24 h−1) > 10~20 cm (1.02~0.73 mg·g−1·24 h−1),其变化范围为0.625~1.297 mg·g−1·24 h−1,且存在显著差异(P < 0.05)。在不同施N浓度中,常绿阔叶林土壤蛋白酶活性表现为先增加后降低的趋势,在LN与MN处理下高于CK处理,增幅在8.4%~30.2%。高山栎林在LN处理下表现为促进作用,增幅在9.5%~23.8%。华山松林与云南松林在各处理下差异不显著。其中,高山栎林表现最高,总体平均值为:高山栎林(1.12 mg·g−1·24 h−1) > 常绿阔叶林(0.91 mg·g−1·24 h−1) > 华山松林(0.83 mg·g−1·24 h−1) >云南松林(0.80 mg·g−1·24 h−1),高山栎林土壤蛋白酶活性高于云南松林34.9%。
Figure 6. Changes of protease activities in different soil layers of four forest types under different N deposition
图7表明,在土壤深度、施N水平和森林类型三者交互作用下,华山林LN处理下0~5 cm土层过氧化氢酶活性最高(0.973 mg·g−1·20 min−1),云南松林LN处理下0~5 cm土层活性最低(0.209 mg·g−1·20 min−1)。常绿阔叶林与云南松林土壤过氧化氢酶活性表现为5~10 cm土层显著高于0~5 cm土层(P < 0.05),不同土层平均值为5~10 cm (0.48~0.45 mg·g−1·20 min−1) > 0~5 cm (0.44~0.33 mg·g−1·20 min−1) > 10~20 cm (0.41~0.29 mg·g−1·20 min−1)。华山松林与高山栎林土壤过氧化氢酶活性则表现为随土层深度增加逐渐降低,降幅分别在55.6%~14.4%和28.1%~14.4%,两种林分不同土层平均值为0~5 cm (0.47~0.36 mg·g−1·20 min−1) > 5~10 cm (0.32~0.30 mg·g−1·20 min−1) > 10~20 cm (0.28~0.27 mg·g−1·20 min−1),且存在显著差异(P < 0.05)。4种林分土壤过氧化氢酶活性变化范围为0.209~0.673 mg·g−1·20 min−1。在不同施N浓度中,常绿阔叶林与华山松林土壤过氧化氢酶活性随着施N水平的增加先增加后减小。高山栎林在HN处理下显著高于CK处理(P < 0.05),增幅为3.9%、16.9%、21.1%。云南松林在HN处理下显著高于CK处理,增幅为30.1%、57.9%、9.1%(P < 0.05)。其中,常绿阔叶林表现最高,总体平均值为:常绿阔叶林(0.45 mg·g−1·20 min−1) > 云南松林(0.36 mg·g−1·20 min−1) > 华山松林(0.34 mg·g−1·20 min−1) > 高山栎林(0.32 mg·g−1·20 min−1),常绿阔叶林土壤过氧化氢酶活性高于高山栎林40.6%。
Figure 7. Changes of catalase activity in different soil layers of four forest types under different N deposition
图8表明,在土壤深度、施N水平和森林类型三者交互作用下,云南松林CK处理下0~5 cm土层多酚氧化酶活性最高(1.969 mg·g−1·20 min−1),高山栎林MN处理下0~5 cm土层活性最低(0.156 mg·g−1·20 min−1)。常绿阔叶林与华山松林土壤多酚氧化酶活性表现为随土层深度增加逐渐降低,降幅分别在73.3%~52.6%和50.0%~11.1%,两种林分不同土层平均值为0~5 cm (1.49~1.23 mg·g−1·20 min−1) > 5~10 cm (1.02~0.87 mg·g−1·20 min−1) > 10~20 cm (0.73~0.59 mg·g−1·20 min−1),且存在显著差异(P < 0.05)。高山栎林与云南松林则大部分表现为5~10 cm > 0~5 cm > 10~20 cm,10~20 cm土层为5~10 cm的23.6%~74.4%,0~5 cm土层为5~10 cm的15.4%~94.7%。4种林分土壤多酚氧化酶变化范围为0.156~1.969 mg·g−1·20 min−1。在不同施N浓度中,常绿阔叶林土壤多酚氧化酶活性在HN处理下显著抑制(P < 0.05),降幅为42.7%~35.7%;华山松林与高山栎林在LN、MN和HN处理下基本表现为抑制,降幅在49.4%~9.1%;云南松林在HN处理下高于CK处理,增幅在80.0%~27.7%。其中,常绿阔叶林表现最高,总体平均值为:常绿阔叶林(1.03 mg·g−1·20 min−1) > 华山松林(0.94 mg·g−1·20 min−1) > 云南松林(0.89 mg·g−1·20 min−1) > 高山栎林(0.84 mg·g−1·20 min−1),常绿阔叶林土壤过氧化氢酶活性高于高山栎林22.6%。
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多因素方差分析表明(表2):除施N水平对酸性磷酸酶以及土壤深度、施N水平和森林类型三者交互作用对脲酶无显著影响外(P > 0.05),土壤深度、施N水平、森林类型和三者交互作用对土壤蔗糖酶、淀粉酶、脲酶、天门冬酰胺酶、酸性磷酸酶、蛋白酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶均具有极显著影响(P < 0.01)。其中,蔗糖酶、淀粉酶、蛋白酶和过氧化氢酶表现为:森林类型的影响最大,土壤深度次之,施N水平和三者交互作用最小;脲酶表现为:森林类型影响最大,施N水平次之,土壤深度和三者交互作用最小;天门冬酰胺酶和酸性磷酸酶表现为:土壤深度影响最大,森林类型次之,施N水平和三者交互作用最小;多酚氧化酶表现为:土壤深度的影响最大,施N水平次之,森林类型和三者交互作用最小。
处理
treatments自由度
degree of
freedom蔗糖酶
Invertase淀粉酶
Amylase脲酶
Urease天门冬酰胺酶
Asparaginase酸性磷酸酶
Acid
phosphatase蛋白酶
Proteases过氧化氢酶
Catalase多酚氧化酶
Polyphenol oxidase(n) F P F P F P F P F P F P F P F P 土壤深度
Depth of soil2 2 900.547 0 1 272.361 0 10.599 0 4 348.792 0 113.033 0 203.603 0 299.095 0 475.996 0 施N水平
N treatments3 703.187 0 270.02 0 12.27 0 632.786 0 2.29 0.083 19.672 0 76.454 0 146.08 0 森林类型
Forest type3 11 497.743 0 1 335.865 0 15.7 0 655.714 0 29.176 0 407.082 0 464.355 0 40.5 0 土壤深度×施N水平×
森林类型
Depth of soil×
N treatments ×
Forest type18 40.183 0 52.138 0 0.955 0.517 99.326 0 2.519 0.002 4.49 0 62.002 0 21.548 0 “P > 0.05”表示无显著影响;“0.05 > P > 0.01”表示显著影响;“P < 0.01”表示极显著影响。 Table 2. Multivariate ANOVA of soil enzyme activity by different soil depth, different N treatments and different forest types
土壤深度对土壤酶活性的影响力为:天门冬酰胺酶>蔗糖酶>淀粉酶>多酚氧化酶>过氧化氢酶>蛋白酶>酸性磷酸酶>脲酶;施N水平对土壤酶活性的影响力为:蔗糖酶>天门冬酰胺酶>淀粉酶>多酚氧化酶>过氧化氢酶>蛋白酶>脲酶>酸性磷酸酶;森林类型对土壤酶活性的影响力为:蔗糖酶>淀粉酶>天门冬酰胺酶>过氧化氢酶>蛋白酶>多酚氧化酶>酸性磷酸酶>脲酶。三者交互作用对土壤酶活性的影响力为:天门冬酰胺酶>过氧化氢酶>淀粉酶>蔗糖酶>多酚氧化酶>蛋白酶>酸性磷酸酶>脲酶。