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微管是由α、β-微管蛋白以异二聚体的形式组装而成的中空管状结构[1]。植物细胞中,微管可以快速的聚合或者解聚、迅速转变微管列阵,对细胞的正常扩张和分化具有重要作用。微管结合蛋白(MAP)是一类对微管的组装和功能具有调控作用的蛋白[2]。Changjie等最早从烟草(Nicotiana tabacum L.) BY-2 (‘Bright Yellow-2’)悬浮培养细胞中分离得到一类与微管紧密结合且分子量约为65 kD的蛋白,即MAP65[3]。MAP65蛋白通常定位于一种或几种微管列阵上,是一类可与微管交联并促进微管成束的微管结合蛋白[4]。
从烟草BY-2悬浮培养细胞中分离出小原生质体,制备胞质提取物,之后加入紫杉醇协助组装微管,再将微管和MAP低温高速离心以去组装,经过数次组装-去组装循环,分离得到3个烟草MAP65蛋白[5]。后用同样的方法在胡萝卜(Daucus carota L.)悬浮细胞中分离得到3个胡萝卜MAP65蛋白[6]。随着拟南芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)与水稻(Oryza sativa L.)基因组测序的完成,拟南芥和水稻中分别鉴定出了9和11个MAP65蛋白家族成员[7-8]。小立碗藓 (Physcomitrella patens (Hedw.) Bruch & Schimp.)中克隆得到了5个MAP65基因[9]。对拟南芥MAP65蛋白家族的研究表明,9个成员之间氨基酸相似性为28%~79%,C端序列同源性尤其低,C端包含与微管特定结合的结构域,决定了微管聚合的速率,不同基因的C端微管结合结构域不同,故以不同的效率促进微管聚合[10]。ATMAP65-1和ATMAP65-2促进扩增细胞的轴向生长,但不是维持细胞营养生长和生殖生长所必需[11]。ATMAP65-3的缺失导致成膜体异常,胞质分裂不完全及植株发育异常[12]。ATMAP65-4和ATMAP65-3具有高度同源性,功能相似,交联成膜体中的相邻反向平行的微管,这2个基因的同时缺失会导致植株生长受到严重影响[13]。ATMAP65-5在整个细胞周期中均有表达,且对微管解聚药具有更强的耐受力[14]。ATMAP65-6对微管聚合没有促进作用,但可诱导微管形成网状结构,该蛋白定位于线粒体,可能参与线粒体相关功能的实现[15]。植物中MAP65基因家族的成员数量较多,且在细胞周期的不同微管列阵中具有不完全相同的定位模式,在不同组织中的表达量亦存在差异,这预示该基因家族在植物中具有功能的分化[10,16-17]。
毛果杨(Populus trichocarpa Torr. & Gray)作为第一个完成基因组测序的木本植物,为鉴定木本植物MAP65基因家族成员和分析其进化及功能提供了可能[18]。本研究在毛果杨中鉴定出9个MAP65,通过其理化性质分析、亚细胞定位的预测、系统进化分析、基因结构和保守结构域分析、共线性分析及同义突变频率 (Ks)、非同义突变频率(Ka)分析、组织表达量以及启动子顺式作用元件分析,探究了PtMAP65基因家族的进化扩张模式,以期揭示PtMAP65基因家族的进化生物学意义,并为进一步研究PtMAP65基因家族成员的潜在功能提供新的线索。
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通过在线BLASTP比对,从毛果杨中鉴定出14个候选的MAP65s。SMART和NCBI-CDD 分析结果显示:14条蛋白序列都具有完整或不完整的MAP65_ASE1 结构域 (PF03999);经过比对建树分析,删除影响树形的序列,最后得到9个MAP65s。根据其在染色体上的分布情况,将其命名为PtMAP65-1到PtMAP65-9(表1)。PtMAP65蛋白家族成员的氨基酸长度变化范围为570~730 aa,分子量变化范围为64.65~83.00 kDa,等电点变化范围为5.17~8.45。综合考虑PtMAP65蛋白家族成员用3种方法预测的亚细胞定位,最终预测:PtMAP65-1、PtMAP65-3和PtMAP65-9位于细胞核,PtMAP65-8位于叶绿体,其余成员位于细胞质。
基因名称
Gene name基因登陆号
ID (Phytozome v12.1)DNA长度
DNA length/bpCDS长度
CDS length/bp氨基酸长度
amino acid length/aa分子量
Molecular weight/kDa等电点
pI预测的亚细胞定位
Predicted subcellular localizationPtMAP65-1 Potri.001G055100 4 089 1 809 602 68.73 5.70 细胞核 PtMAP65-2 Potri.001G356500 5 285 1 746 581 65.05 5.17 细胞质 PtMAP65-3 Potri.003G173300 4 551 1 779 592 67.62 5.87 细胞核 PtMAP65-4 Potri.003G192400 6 668 1 713 570 64.65 7.25 细胞质 PtMAP65-5 Potri.008G139700 7 530 1 803 600 68.12 7.14 细胞质 PtMAP65-6 Potri.011G092500 4 939 1 749 582 65.37 5.21 细胞质 PtMAP65-7 Potri.012G129600 4 717 1 755 584 67.08 5.41 细胞质 PtMAP65-8 Potri.014G070100 4 294 2 163 720 81.53 8.45 叶绿体 PtMAP65-9 Potri.015G131400 4 795 2 193 730 83.00 5.65 细胞核 Table 1. The information of the PtMAP65 gene family
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为研究植物MAP65-Likes的系统进化关系,采用邻接法对毛果杨、拟南芥、烟草、水稻、巨桉、挪威云杉等物种的MAP65-Like蛋白构建系统进化树,校验参数(Bootstrap)分别为1 000次和5 000次重复,结果差异很小,图1中系统进化树的Bootstrap为1 000。从图1可以看出:该植物基因家族分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ5个亚组,裸子植物的MAP65-Likes仅分布于Ⅰ亚组和Ⅴ亚组中,且独立地聚为一簇;被子植物的MAP65-Likes在5个亚组中均有分布,且单子叶和双子叶植物MAP65s均匀地分布于各个亚组,这说明5个亚组的分化发生于裸子植物和被子植物分化之后、单子叶植物和双子叶植物分化之前。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4个亚组中,单子叶植物和双子叶植物的MAP65-Likes各自聚为一簇,在Ⅴ亚组中,双子叶植物毛果杨、拟南芥和烟草的4个MAP65-Likes聚为一簇,其他8个MAP65-Likes与单子叶植物水稻的3个MAP65s聚为一簇。在Ⅰ亚组中,PtMAP65-2/PtMAP65-6组成旁系同源基因对,并与ATMAP65-1/ATMAP65-2这一对旁系同源基因聚为一支;在Ⅱ亚组中,PtMAP65-4/Eucgr.J00083.1组成直系同源基因对,并与ATMAP65-5聚为一支;在Ⅲ亚组中,PtMAP65-1/PtMAP65-3组成旁系同源基因对,并与Eucgr.B03489.1聚为一支;在Ⅴ亚组中,PtMAP65-7/PtMAP65-9组成旁系同源基因对,并与旁系同源基因对Eucgr.K00145.1/Eucgr.A02875.1聚为一支,另外,PtMAP65-8/ATMAP65-4组成直系同源基因对;在Ⅳ亚组中,PtMAP65-5/Eucgr.G02071.1组成直系同源基因对,这表明MAP65家族中毛果杨与巨桉的亲缘关系最近,这也与二者是多年生木本植物相一致。
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为分析MAP65家族成员的基因结构特征,利用GSDS绘制了毛果杨、拟南芥、烟草和水稻MAP65家族成员的基因结构图。图2A表明:在Ⅰ亚组中,9个MAP65s有9个外显子、8个内含子,仅ATMAP65-1有8个外显子、7个内含子;在Ⅱ亚组中,MAP65有11个外显子、10个内含子;在Ⅲ亚组中,3个MAP65有11个外显子、10个内含子,LOC_Os08g41890.1有10个外显子、9个内含子;在Ⅳ亚组中,5个MAP65有11个外显子、10个内含子,仅LOC_Os03g50970.1有13个外显子、12个内含子;在Ⅴ亚组中,MAP65的外显子个数为9~12、内含子个数为8~11。另外,在各个亚组中,外显子的长度相似,内含子的长度差异较大,而同一物种的MAP65之间的内含子长度更相似。
利用MEME分析了MAP65蛋白家族的保守结构域。图2B表明:各个MAP65蛋白家族成员具有11~15个不等的结构域,第1、2、3、4、6、7、8、9、11、12和15个结构域较保守,在32条MAP65蛋白序列中均有分布。另外,植物MAP65蛋白序列的C端结构域较多变,各个亚组的MAP65蛋白具有相似的结构域分布。
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根据毛果杨基因组序列文件和注释文件,分析了9个PtMAP65基因在染色体的定位情况。PtMAP65-1和PtMAP65-2位于Chr01,PtMAP65-3和PtMAP65-4位于Chr03,PtMAP65-5到PtMAP65-9分别位于Chr08、Chr11、Chr12、Chr14和Chr15。毛果杨基因组内共线性分析结果显示:MAP65基因家族中共有6对复制基因,且均为片段复制,其中PtMAP65-7、PtMAP65-8和PtMAP65-9互为复制基因(图3)。利用DnaSP5计算复制基因对的Ka和Ks,算得的Ks值为0.2341~1.9338,表明复制时间最早发生于106.25百万年前,最晚发生于12.86百万年前;除复制基因对PtMAP65-4/Potri.001G032566的Ka/Ks为0.617 3外,其余复制基因对的Ka/Ks < 0.25,表明PtMAP65基因家族在进化过程中受到强纯化选择的作用(表2)。
复制基因对
Pair of duplication gene同义突变频率
Ks非同义突变频率
Ka非同义突变率与同义突变率的比值
Ka/Ks复制时间/(百万年前)
Duplication time/(Million years ago)PtMAP65-1 PtMAP65-3 0.242 3 0.047 6 0.196 5 13.31 PtMAP65-2 PtMAP65-6 0.276 7 0.044 3 0.160 1 15.20 PtMAP65-4 Potri.001G032566 0.234 1 0.144 5 0.617 3 12.86 PtMAP65-7 PtMAP65-8 1.933 8 0.307 3 0.158 9 106.25 PtMAP65-7 PtMAP65-9 0.242 2 0.056 7 0.234 1 13.31 PtMAP65-8 PtMAP65-9 1.761 2 0.300 0 0.170 3 96.77 Table 2. Ks and Ka analysis of duplicated gene pairs
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为了解转录调控机制,利用PlantCARE数据库分析PtMAP65基因家族启动子的顺式作用元件。根据顺式作用元件的功能,将其分为光响应元件、激素响应元件、逆境胁迫响应元件和植物生长发育元件。图4表明:在PtMAP65基因家族中,光响应元件和激素响应元件的个数较多,逆境胁迫响应元件和植物生长发育元件的个数较少;PtMAP65-3中的激素响应元件远多于其他基因,PtMAP65-4、PtMAP65-7和PtMAP65-8中未预测到植物生长发育元件。
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从Populus eFP browser数据库下载得到PtMAP65基因家族成员在成熟叶、幼叶、根、雌花、雄花和木质部中的表达数据,绘制热图。图5表明:复制基因对PtMAP65-2/PtMAP65-6在幼叶、根和木质部均有高度表达;复制基因对PtMAP65-7/PtMAP65-8在雌花和雄花中高度表达;PtMAP65-3在木质部中表达量最高;PtMAP65-1和PtMAP65-4主要在幼叶和雌花中表达;PtMAP65-5在幼叶和根中表达水平较高;PtMAP65-9在各个组织表达水平较低。