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松枯梢病是世界范围内针叶树上最常见和分布最广的重要病害之一。枯梢病病原菌为松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea (Fr.) Dyko & B. Sutton.),病菌侵染主要从寄主伤口处侵入,1997年Stanosz对Pinus resinosa Loisel.和北美短叶松(Pinus banksiana Lambert.)的研究中首次发现无病斑的嫩梢上存在潜伏侵染[1]。刘艳在多个松属树种套袋隔离的实验中,发现冬季表面无病斑的梢上存在松枯梢病菌定殖的情况,来年可造成春梢发病[2]。松枯梢病已在我国10余个省份的松林中发生,对松树人工林造成了严重的危害,损失巨大,已列入我国重要的森林病害进行研究。
植物内生细菌在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于植物的各种组织和器官内部,并与植物建立和谐联合关系。随着对植物内生细菌在促进植物生长、生物控制和缓解胁迫等方面的深入研究[3],寄主植物内生细菌与病害的研究也越来越受到关注。内生细菌通过多种机制共同作用从而减轻或防止有害致病微生物对寄主的影响[4],机制包括抗生(代谢物质生产)、生长促进、诱导宿主防御(诱导系统抗性)、寄生、竞争和信号干扰(群体感应)[5]。内生细菌通过生物固氮、加速消化、增磷和产生植物激素直接作用于植物的生长发育,从而产生对生物因子的抗性[6]。松枯梢病作为真菌病害,在其拮抗细菌方面已有相关研究,如通过对健康及染病针叶的内生细菌进行分离培养,获得具有生防潜力的内生细菌[7],但关于枯梢病菌对松树内生细菌多样性及群落结构的影响方面未见相关研究。
昆嵛山是赤松(Pinus densiflora Sieb. et Zucc.)的原生地和天然分布中心,与黑松(Pinus thunbergii Parl.)、麻栎(Quercus acutissima Carruth.)等共组成地带性天然次生林植被。为探究混交林中枯梢病对寄主内生细菌的影响,选取典型混交林型针阔混交林(赤松-麻栎)和针叶混交林(赤松-黑松),测定两种混交林中赤松针叶内生细菌的变化,探明不同枯梢病发病状态下赤松针叶的内生细菌多样性及群落结构,分析内生细菌的多样性及群落结构差异,为松枯梢病的细菌群落结构调控提供理论依据。
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测序结果显示,在针阔混交林ZK的12个样品中共获得细菌有效序列388 587条,共计679个OTU;在针叶混交林CZ的12个样品共获得细菌有效序列336 600条,共计656个OTU。各样品Coverage测序深度指数统计分析结果见表1,结果显示采集针叶样本中覆盖率均接近于99%,且图1稀释曲线趋势平缓,说明各样本中的细菌物种信息被充分检测,结果能够代表各类针叶中细菌的真实水平。
处理
Treatment丰富度
Chao1多样性指数
Shannon覆盖率
Coverage处理
Treatment丰富度
Chao1多样性指数
Shannon覆盖率
CoverageZK1 389.69 ± 43.34 a 6.85 ± 0.30 a 99.0% CZ1 419.02 ± 49.29 a 6.48 ± 0.85 a 99.0% ZK2 339.33 ± 59.58 ab 6.16 ± 0.78 a 99.1% CZ2 328.10 ± 37.21 ab 5.75 ± 0.47 a 98.8% ZK3 337.10 ± 47.61 ab 5.70 ± 0.84 ab 99.1% CZ3 225.56 ± 27.03 b 5.27 ± 0.63 ab 99.3% ZK4 218.59 ± 40.24 b 4.45 ± 0.77 b 99.2% CZ4 192.50 ± 26.06 b 4.74 ± 0.42 b 99.1% 注:测定值为均值 ± 标准差,同列中不同字母表示显著差异(P < 0.05)。
Note: Values were mean ± standard deviation, values within the same column followed by different letters indicated significant differences (P < 0.05).Table 1. Abundance and diversity of endosphere bacteria in different level of disease in the needles of P. densiflora
Figure 1. OTU-based rarefaction curves of bacteria in needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-l eaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)
根据内生细菌OTU数目,对样品中OTU组成进行分析,构建Venn图(图2)和群落结构柱状图(图3,4,5)。根据图2a,在针阔混交林ZK中不同染病程度的针叶中共有相同的OTU 83个,占OTU总数的12.22%,4类针叶中特有的OTU数目分别为90、69、59、25个,以ZK1中特有OTU数目最多。根据图2b,在针叶混交林CZ中不同染病程度的针叶中共有相同的OTU 69个,占OTU总数的10.51%,4类针叶中特有的OTU数目分别为120、79、66、45个,同样以CZ1中特有OTU数目最多。
Figure 2. Venn diagram of OTU distribution of endosphere bacteria in different level of disease in the needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)
Figure 4. Bacterial classes from endosphere bacteria of different level of disease in needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)
Figure 5. Bacterial genera from endosphere bacteria of different level of disease in needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)
样本内细菌的Chao1指数和Shannon指数统计分析结果见表1,针阔混交林与针叶混交林中的内生细菌多样性及丰度呈现相同的变化趋势。无病斑赤松针叶内生细菌的Chao1和Shannon指数最高,即测得OTU数与种类数均最高,其次分别为染病赤松上的无病斑针叶、病斑长度为针叶长度二分之一以下的赤松针叶、病斑长度为针叶长度二分之一以上的赤松针叶,随着病菌侵染的加重,内生细菌丰富度及多样性呈现出下降的趋势。
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在针阔混交林中,对679个OTU进行门、纲和属水平上的归类,分属28个门、69个纲、205个属。在门水平上(图3a),变形菌门(Proteobacteria)占比最高,分别在4类样品中占比55.39%、62.89%、38.53%、71.42%,变形菌门为针叶内生细菌中的优势菌群,且在样本中的相对丰度存在差异。ZK1中相对丰度较高的门还有放线菌门(Actinobacteria)(11.42%)、酸杆菌门(Acidobacteria)(8.09%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(5.78%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)(4.61%)。ZK2中相对丰度较高的门同ZK1一致,占比略有差异,放线菌门(9.85%)、酸杆菌门(7.84%)、拟杆菌门(4.07%)、芽单胞菌门(3.68%)。ZK3中相对丰度较高的门还有厚壁菌门(Firmicutes)(32.60%)、酸杆菌门(6.72%)、放线菌门(10.98%)。ZK4中相对丰度较高的门还有酸杆菌门(14.61%)、浮霉状菌门(Planctomycetes)(4.41%)、放线菌门(2.89%)。
Figure 3. Bacterial phyla from endosphere bacteria of different level of disease in the needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)
在针叶混交林中,对656个OTU进行门、纲和属水平上的归类,分属29个门、65个纲、190个属。在门水平上(图3b),变形菌门相对丰度最高,分别为54.45%、56.24%、63.48%、74.83%。CZ1中的相对丰度较高的门还有酸杆菌门(9.03%)、拟杆菌门(8.63%)、厚壁菌门(7.43%)、放线菌门(6.11%)。CZ2中种类构成与CZ1相近,其中厚壁菌门(15.69%)相对丰度上升,酸杆菌门(6.51%)与拟杆菌门(4.58%)相对丰度降低,放线菌门(6.31%)相对稳定。CZ3中的相对丰度较高的门还有厚壁菌门(11.09%)、酸杆菌门(12.08%)、放线菌门(1.46%)。CZ4中相对丰度较高的门还有酸杆菌门(11.09%)、浮霉状菌门(4.18%)、放线菌门(2.86%)。
两种混交林中,无病斑针叶的内生细菌门水平结构一致,变形菌门均为优势门,且其他相对丰度较高的菌门近似,包括放线菌门、酸杆菌门、拟杆菌门和芽单胞菌门。随着枯梢病的发生,在病斑较短的针叶中,均发生显著的变化,两种林分在该状态下的内生细菌差异最大,主要差异由于针阔混交林中厚壁菌门相对丰度的升高。在病斑较长的针叶内生细菌优势菌门一致,均由变形菌门、酸杆菌门、浮霉状菌门和放线菌门构成,相对丰度无显著差异。
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在针阔混交林中,内生细菌纲水平构成见图4a,无病斑及染病针叶内生细菌均以α-变形菌(Alphaproteobacteria)为优势菌种,分别为34.26%、42.30%、28.53%和63.68%。在ZK1中,β-变形菌纲(Betaproteobacteria)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)的占比分别为10.05%和7.06%,ZK2中β-变形菌纲和γ-变形菌纲的占比分别为12.06%和5.20%。ZK3中特有芽孢杆菌纲Bacilli,占比为28.18%。ZK4中,α-变形菌占比增高,且酸杆菌纲(Acidobacteria)(14.07%)和浮霉菌纲(Planctomycetacia)(4.41%)占比高于其他样品(均低于1%)。
针叶混交林中,在内生细菌纲水平上(图4b),4类样品中α-变形菌相对丰度均为最高,相对丰度分别为31.21%、39.51%%、52.66%和58.10%,呈现逐渐增高的趋势。β-变形菌纲相对丰度分别为12.55%、10.36%、6.11%和4.98%,γ-变形菌纲相对丰度分别为5.64%、3.39%、2.92%和1.73%,两个纲的相对丰度均逐渐下降。芽孢杆菌纲(Bacilli)在CZ1、CZ2和CZ3中占比较高,3.32%、14.81%、7.10%,而CZ4中低于1%。CZ4中的δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)(10.03%)、酸杆菌纲(10.56%)和浮霉菌纲(4.12%)占比较高。
两种林分中,无病斑针叶内生细菌的优势纲为α-变形菌纲。在染病初期,内生细菌的丰度差异主要来自于芽孢杆菌纲的丰度变化。在针阔混交林中,芽孢杆菌纲在病斑较短的针叶中占比显著高于其他样本。在病斑较长的针叶中,α-变形菌纲、酸杆菌纲和浮霉菌纲在两种林分中组成优势菌群。
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在针阔混交林中,属水平上(图5a),unidenified的属占了较高的比例(42.40%、43.43%、32.89%、49.26%),在ZK1中,Massilia、Endobacter、Bryocella与Sphingomonas的相对丰度均较高,4个属的占比分别达到了4.51%、3.20%、3.20%、1.68%。ZK2中,Massilia、Endobacter、Bryocella与Sphingomonas同样占据了较高的比例(4.46%、5.73%、5.04%、2.28%),与ZK1的优势菌属一致。ZK3中,乳杆菌属(Lactobacillus)、Kroppenstedtia、Bryocella、魏斯氏菌(Weissella)相对丰度较高(16.5%、8.09%、5.47%、2.36%),其中乳杆菌属占比最高,Massilia、Endobacter和Sphingomonas相对丰度降低。在ZK4中Bryocella、Endobacter、Singulisphaera和Sphingomonas相对丰度较高(13.82%、13.13%、4.39%、2.76%)。
针叶混交林中(图5b),unidenified的属同样占了较高的比例(36.59%、36.92%、38.38%、51.66%)。CZ1中Bryocella(5.11%)、Massilia(4.52%)、硝化螺旋菌属(Nitrospira)(4.32%)、Clostridium_sensu_stricto_1(3.59%)、Endobacter(2.99%)、薄层菌属(Hymenobacter)(2.86%)和Sphingomonas(2.39%)占比较高,CZ2中乳杆菌属(6.97%)、Endobacter(4.91%)、Bryocella(4.78%)和Kroppenstedtia(4.12%)占比较高,与CZ1的优势菌存在差异。CZ3中,Bryocella(7.84%)、Endobacter(7.44%)、乳杆菌属(4.52%)、Sphingomonas(2.72%)、甲基杆菌属(Methylobacterium)(2.66%)和Granulicella(2.19%)占比较高,其中Granulicella明显高于其他样品。CZ4中,相对丰度较高的菌有Bryocella(8.50%)、Endobacter(8.37%)、甲基杆菌属(8.10%)、Singulisphaera(3.98%)、Sphingomonas(3.45%)和Methylocella(2.72%),其中甲基杆菌属与Singulisphaera在其他样品中相对丰度低于1.00%。
两种林分中,无病斑针叶共有的优势属有Massilia、Endobacter、Bryocella与Sphingomonas,其它优势属硝化螺旋菌属、Clostridium_sensu_stricto_1相对丰度有差异,但并不显著。枯梢病侵染后,在病斑较短的针叶内细菌的属中,Lactobacillus相对丰度的差异最大。在病斑较长的针叶中,Bryocella、Endobacter、Singulisphaera、Sphingomonas在两种林分中均为优势属。
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基于细菌纲水平的主成分分析,分析针阔混交林ZK赤松针叶细菌的差异性(图6a),结果表明,主成分PC1与主成分PC2的贡献率分别为63.6%和26.4%,发病较重的针叶内生细菌与其余3类相聚较远,表明在枯梢病侵染较严重的情况下,内生细菌多样性的变化较大,而无病斑针叶以及染病程度较轻的距离较近。染病较轻的状态下与无病斑状态相比,针叶内生细菌的构成差异较小。针叶混交林CZ主成分分析(图6b),主成分PC1与PC2的贡献率分别为71.17%和13.5%,其聚类规律与针阔混交林ZK一致。