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焦枯病是近年来树木或植物常见的一类叶部病害。其病因复杂,多由不适环境因素引起,如营养元素过量和钾元素缺乏、干旱胁迫、高温日晒等,造成植物水分生理失调,导致叶组织大面积产生枯斑,引发叶焦枯[1–2]。随着气候变暖和环境变化,病原菌导致植物叶焦枯病的种类增多,如由侵染性病原菌真菌拟茎点霉Phomopsis mollissim与其共生菌板栗蛇孢日规壳Ophiognomonia castaneae引起的板栗褐缘叶枯病[3–4];通过昆虫媒介传播的植物病原细菌木质部难养菌Xylella fastidiosa导致的叶焦枯病也日益频发。该细菌病原菌营养需求复杂、寄主范围很广,在多种重要的林木、观赏性植物及农业经济作物形成严重危害,已经成为全球性日益关注的新发流行病害[5–6]。
中国板栗(Castanea mollissima Bl.)属于壳斗科栗属的植物,原产于中国,有“干果之王”之称[7–8],河北板栗主要产于河北省北部的燕山山区,以颗粒饱满、香甜、皮薄、适于糖炒等特点著称于世,久负盛誉,是河北省出口农副产品中具有较大优势的土特产品之一,其产量、出口量和质量,均居全国第一位[8–9]。并且,板栗栽种面积占到全省有林地的10%,成为河北省重要的经济和生态树种[10]。近些年,青龙、迁西等板栗主产地相继发生一种新的叶部病害,板栗发病后,叶片上产生黄褐色的斑点,多个黄褐斑可渗透连片,以致使整个叶片上呈不规则的大面积焦枯状,引起果实重量减少,产量下降,造成栗农经济损失,该病害发病原因亟待明确,尽早进行有效的防控。
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标本于2019年7月至9月,采于河北青龙县和迁西县(40.40° N, 118.95° E)5个病害发生严重的板栗果园,果园相距5~70 km。在栗园,观察症状的同时,放大镜镜检病症;在实验室,解剖镜镜检病组织表面病症,及显微镜镜检病组织真菌分生孢子器和子实体或细菌雾;实验室新鲜离体病叶组织湿培25℃,每天观察病症至第7天。
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病原菌的分离和纯化采用组织分离法[11],将新鲜的病叶用清水冲洗干净,用75% 乙醇表面消毒,从其病健交界处用灭菌手术刀切取3~5 mm, 置于PDA培养基、MEA培养基和细菌蛋白胨培养基上25℃恒温培养,待菌丝或菌落长出后,进行转接纯化,并在PDA培养基上于25℃恒温培养,菌丝长满后,置于4℃冰箱中保存备用。每户叶片组织接种12个平板,每个PDA平板接3块组织。
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分离菌株按形态初步归类后,用CTAB法提取和纯化菌株的基因组DNA[12],用通用引物ITS1和ITS4进行ITS rDNA基因片段的扩增,PCR产物经回收纯化后,由北京六合华大基因有限公司进行测序。所得序列经NCBI进行碱基Blast同源性分析,确定菌株分类地位。利用Mega X构建系统发育树,建树方法最大简约法(Maximum parsimony,MP),可靠性检验bootstrap法,初始值1000次,外群为Acervus globulosus HKAS 88987,系统发育树中本研究测得的序列号为MT373425-MT373459,Genbank中下载用于比对分析做系统发育树的序列见表1。
序列来源
Source菌株号
Strain No.ITS序列号
ITS No.Alternaria alternata isolate Alt-C81 MN044802 Colletotrichum gloeosporioides IMI 356878 from type material NR_160754 Colletotrichum fructicola MFLU 090228 from type material NR_144783 Nigrospora oryzae isolate VARB205 KT966519 Ophiognomonia setacea CBS 128354 MH864895 Alternaria solani CBS 109158 KJ718239 Alternaria arborescens CBS 102605 NR_135927 Phomopsis sp. GJS 83-377 AF102999 Gnomoniopsis smithogilvyi CBS 130190 NR_166040 Coniothyrium pyrinum CBS 110.40 MH856053 Biscogniauxia sp. strain LPS-70 MF379340 Glomerella sp. isolate ERS038 KY413720 Leptostroma sp. strain Ecf-5 MK211262 Sporormiella sp. strain LTL532 MF663586 Dothiorella gregaria isolate hz-S8 FJ517548 Acervus globulosus HKAS 88987 NR_159565 Table 1. Sequences from Genbank for alignment and phylogenetic tree
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依据1.3的结果,结合已报道致病性的菌株进行接种试验。室内离体接种选取健康无病的新鲜叶片,叶片采自温室1年健康苗的成熟叶片(停止伸展发育后20~30天),用清水冲洗干净,75% 乙醇消毒5 min,再用无菌水冲洗多次,置于事先灭菌的培养皿(直径150 mm,底部垫2~3层无菌滤纸,并加入适量无菌水保湿)中。因为发现在培养观察期间,分离菌株培养有产孢和不产孢,因此,接种体前者用分生孢子,后者用菌丝(菌饼)。将PDA平板上培养5~7天的分离物,无菌水冲洗孢子,制成106孢子·mL−1接种液;或用直径5 mm的打孔器在菌落边缘取菌饼。预实验发现无伤接种不成功,因此,用刺伤进行接种(用消毒昆虫针在健康叶片表面针刺后,将菌饼贴接于刺伤部位)。每处理接种5个叶片,每片叶接3个点,另以叶片相同部位接种无菌水处理为对照。接种封好后置于25℃培养箱黑暗培养。接种48 h后移去菌丝块,隔天观察发病情况并记录两周。
根据离体叶片接种结果,选取病原菌进行1年生盆栽苗接种实验,将菌丝块接种盆栽苗板栗叶片上,每种致病菌株接种3盆苗木,每苗木处理5个叶片,并用无菌水同时接种等数量的盆栽板栗苗作为对照,保鲜袋保湿24~48 h后去掉,定期观察发病情况。发病后取具有症状的组织再次进行病原菌分离。
1.1. 标本采集及病征观察
1.2. 病原菌分离
1.3. 分离纯化菌株的分子鉴定
1.4. 潜在病原菌离体叶片及板栗盆栽苗接种
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病害在河北板栗园6月开始发病,病树整树叶片均出现症状,发病树木相对集中(图1a),果园树病率10%~50%,单株病叶率可至100%。该病害主要症状是,初始在叶片锐齿尖现褐色小点坏死(图1b),随着时间,顺沿叶缘至两侧脉之间的叶间组织呈现黄褐色至黑褐色病斑,病斑形状不规则,边缘不整齐,大小为2~3 cm,每叶片上能产生多个病斑(图1c),多个黄褐斑可渗透连片,以致使整个叶片上呈不规则的大面积焦枯状,均出现在叶脉间的叶组织上,病斑病健部有不规则宽度的亮黄色边缘线(图1d)。但病害不造成早期落叶。林间病叶未见病症。室内显微镜观察,也未见显著真菌分生孢子器和子实体。室内病组织保湿培养3天后,可镜检到链隔孢属Alternaria的分生孢子。栗园发病症状如图1。
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栗园及室内在新鲜症状组织上均没有观察或镜检到病症,湿培3天后的病组织表面上可见有分散的较暗的细点,镜检确认是链隔孢属Alternaria的产孢梗及其分生孢子,极易被从病组织表面抹去。显微镜镜检也没有发现病健交界组织中的细菌菌溢现象。
病叶组织分离纯化共获得有效菌株102株,均为真菌。在菌落形态聚类的基础上,选取菌株扩增ITS。结果这些真菌归属于10科,12属,15种,丰度最高为Alternaria alternata(表2)。分离菌株的系统发育树见图2。分离菌株的主要培养物形态见图3。
分离菌号
Codes分离物鉴定
Isolates分离物数
Number of
isolates分离频率
Isolated
frequencies /%Bl21 Alternaria alternata 53 51.96 Bl36 Colletotrichum gloeosporioides 21 20.58 Bl30 Colletotrichum fructicola 7 6.86 Bl1 Nigrospora oryzae 3 2.94 Bl47 Ophiognomonia setacea 3 2.94 Bl12 Alternaria solani 2 1.96 Bl54 Alternaria arborescens 2 1.96 Bl62 Phomopsis sp. 2 1.96 Bl58 Gnomoniopsis smithogilvyi 2 1.96 Bl66 Coniothyrium pyrinum 2 1.96 Bl39 Biscogniauxia sp. 1 0.98 Bl5 Glomerella sp. 1 0.98 Bl53 Leptostroma sp. 1 0.98 Bl55 Sporormiella sp. 1 0.98 Bl61 Dothiorella gregaria 1 0.98 Table 2. Fungi isolation from leaf scorch samples
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依据文献报道,重点挑选分离菌株中潜在的致病菌进行板栗离体叶片接种实验。选出8个菌:半壳霉属Leptostroma sp.,蛇孢日规壳Ophiognomonia setacea(Pers.) Sogonov,梨盾壳霉Coniothyrium pyrinum(Sacc.) J. Sheld.,稻黑孢菌Nigrospora oryzae (Berk. & Broome) Petch,拟茎点霉属Phomopsis sp.,胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc.,Gnomoniopsis smithogilvyi L.A. Shuttlew., E.C.Y. Liew & D.I. Guest,交链链格孢Alternaria alternata (Fr.) Keissl.。只有其中O. setacea和C. pyrinum两种菌接种的实验叶片出现了病斑,4~5天出现症状,一周后病斑基本稳定,不再变化,病斑位置局限于接种点附近(图4)。记号笔标出了接种部位,而其他几组菌种实验连续观察后均未出现明显病斑症状。另外我们还尝试混合了8种菌丝液,并混合Ophiognomonia setacea和Phomopsis sp.菌丝液进行板栗离体叶片接种实验,但并未出现明显症状。
在O. setacea和C. pyrinum离体叶片致病的基础上,进一步进行了两种菌株的1年生板栗盆栽苗致病实验。结果O. setacea和C. pyrinum两种菌均引起盆栽苗成熟叶片的病变,出现褐色坏死病斑。病斑接种后一周左右出现,大小不定,形状不规则,10~14天后病斑停止扩展趋于稳定(图5)。从发病部位可再次分离到这两种病原菌。