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肠道为昆虫的一个重要器官,由于肠道的特殊生态环境,其中栖息着大量的微生物。昆虫肠道微生物与宿主昆虫的生命活动密切相关,参与摄食、消化、排泄及繁殖等一系列过程,同时还与有毒物质的降解、信息素的合成以及宿主免疫反应等有关[1-3]。植食性昆虫肠道微生物群落的结构与多样性受到所食植物的影响。在对棉铃虫(Helicoverpa armigera)[4]、菜粉蝶(Pieris rapae)[5]、小菜蛾(Plutella xylostella)[6]、松异舟蛾(Thaumetopoea pityocampa)[7]等昆虫的研究中证实,肠道细菌群落的组成与昆虫所食植物叶际细菌群落的组成相似,表明食物是植食性昆虫肠道微生物的重要来源。植食性昆虫啃食植物的同时会给植物造成大量伤口,这些伤口使植物更易受到病原微生物的侵入[8-9]。同时,肠道是病原微生物定殖的重要场所,部分病原微生物可在昆虫肠道内存活,昆虫则成为了病原微生物的越冬场所或来年病害的初侵染来源[10]。
油桐尺蛾(Buzura suppressaria)是为害桉树的重要灾害性食叶害虫,近年来的为害率和为害面积均呈快速上升趋势[11]。在以往的林间调查过程中,我们发现油桐尺蛾虫害与叶部病害经常在同一片桉树林中发生,但究竟是油桐尺蛾先为害然后引起病害侵入?还是病害先侵染桉树,引起植株产生生理生化改变,继而吸引油桐尺蛾为害?或者上述现象仅仅只是一个巧合?由于目前尚未有相关方面的报道,因此有必要对上述问题开展研究。目前对油桐尺蛾的研究主要集中在生物学、生理学、生态学、化学或生物防治等方面[12-14]。鉴于肠道微生物对油桐尺蛾的生命活动有重要影响,因此分析油桐尺蛾肠道微生物群落的结构和多样性,寻找与桉树叶部微生物的关联,对于研究油桐尺蛾与桉树间的互作机理、明确为害规律、寻找新的防治方法均具有重要意义。
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结果显示(表1),5个BS样品的细菌16s rDNA文库测序共获得3 271条有效序列,基于97%的序列相似性进行聚类分析,得到199个OTUs,共注释到6门、11纲、19目、38科、43属;真菌ITS rDNA文库测序共获得280 392条有效序列,得到4 279个OTUs,共注释到8门、29纲、67目、159科、257属。5个BCN样品细菌16s rDNA文库测序共获得11 413条有效序列,得到379个OTUs,共注释到10门、19纲、26目、54科、74属;真菌ITS rDNA文库为287 330条有效序列,获得4 236个OTUs,共注释到8门,31纲,79目,171科,291属。从属水平上看,BCN样品的细菌和真菌数目均多于BS样品。
样品
Sample检测项目
Test items有效reads数目/条
Reads numOTU数目/个
OUT numRDP分类
Classification of RDP门
Phylum纲
Class目
Order科
Family属
GenusBS 细菌 Bacteria 3 271 199 6 11 19 38 43 真菌 Fungus 280 392 4 279 8 29 67 159 257 BCN 细菌 Bacteria 11 413 379 10 19 26 54 74 真菌 Fungus 287 330 4 236 8 31 79 171 291 Table 1. OTU clustering and RDP classification level statistics of BCN and BS samples
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细菌和真菌群落的α多样性检测结果显示(表2),BCN和BS样品物种覆盖率均达97%以上,表明样品所构建的细菌和真菌文库均能有效反应其物种的多样性,且各组样品多样性指数组内偏差较小,数据可靠。BCN样品的细菌ACE指数和Chao l指数均明显高于BS样品,说明病害桉树叶内生细菌的群落丰富度较高,而上述两组样品的真菌ACE指数和Chao l指数则无显著差异,即两者的真菌群落丰富度差异较小。此外,BCN细菌和真菌的Shannon指数、覆盖率、Simpson指数较BS样品均无统计学差异,表明两组样品在细菌、真菌群落多样性、优势菌种的集中程度方面无明显差异。
样品
Sample检测项目
Test itemsOTU数量
OUT numSimpson指数
Simpson indexShannon指数
Shannon indexACE指数
ACE indexChao1指数
Chao1 index覆盖率
coverageBS 细菌 Bacteria 39.80 ± 14.82 0.30 ± 0.10 1.90 ± 0.43 61.37 ± 24.07 53.55 ± 14.68 0.97 ± 0.01 真菌 Fungus 855.80 ± 168.88 0.10 ± 0.05 3.60 ± 0.47 1 098.59 ± 164.90 1 058.26 ± 156.59 1.0 ± 0.00 BCN 细菌 Bacteria 75.80 ± 32.71 0.21 ± 0.07 2.33 ± 0.57 109.82 ± 33.31a 104.12 ± 38.89a 0.98 ± 0.01 真菌 Fungus 847.20 ± 142.69 0.13 ± 0.13 3.50 ± 0.71 1 167.82 ± 103.06 1 094.02 ± 147.21 1.0 ± 0.00 注:a为与BS样品细菌检测组相比,P < 0.05
Note: P is compared with the BS samples in the bacterial detection group, P < 0.05Table 2. Alpha diversity index statistics of BCN and BS samples
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采用PCA法对BCN和BS样品的细菌和真菌群落进行主成分分析(图1A、1B)。从总体上看,BCN与BS样品大致分布在不同区域,表明BCN与BS样品间细菌、真菌的组成和结构存在较大差异。其中,细菌群落分析结果中有1组重复、真菌群落分析结果中有2组重复与其各自所属组别不在同一区域,可能是因为上述3组重复存在的偏差较大,从而导致PCA分析时出现误差,但还需做进一步验证。
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在门水平上(图2A),BCN样品和BS样品的细菌均主要由变形菌门(Proteobacteria)组成,分别占(92.66%~99.65%)和(91.16%~97.56%),即变形菌门为两组样品的优势菌门。
在属水平上(图2B),BCN样品排名前五位的优势菌属分别为假单胞菌属(Pseudomonas)(12.24%~59.14%)、不动杆菌属(Acinetobacter)(6.37%~39.86%)、甲基杆菌属(Methylobacterium)(8.76%~39.11%)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)(0.85%~18.53%)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(1.22%~12.09%);BS样品的优势菌属为假单胞菌属(52.10%~86.97%)和甲基杆菌属(4.42%~27.97%),而不动杆菌属(0.41%~1.66%)、拜叶林克氏菌属(0.2%~0.87%)和鞘氨醇单胞菌属(0.2%~0.62%)的占比较少。
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在真菌门分类水平上(图3A),BCN和BS样品的优势菌门均为担子菌门(Ascomycota),分别占78.68%~93.44%和64.42%~91.55%。
在属水平上(图3),BCN样品中排名前三位的优势菌属分别为平脐疣孢属(Zasmidium)(16.18%~60.82%)、假尾孢属(Pseudocercospora)(5.53%~16.58%)、球腔菌属(Mycosphaerella)(0.84%~10.47%),均为球腔菌科真菌;BS样品中排名前三位的优势菌属分别为平脐疣孢属(12.88%~40.68%)、假尾孢属(10.63%~28.59%)和叶点霉属(Phyllosticta)(4.06%~34.50%),球腔菌属(2.45%~12.33%)则排名第四位。
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BCN和BS样品细菌菌群丰度的T-Test分析结果表明(图4),BCN样品中硝化杆菌属(Nitrobacter)和苯基杆菌属(Phenylobacterium)的丰度明显低于BS样品(P < 0.05),而Terriglobus菌属和鞘脂菌属(Sphingobium)的丰度显著高于BS样品(P < 0.05)。真菌菌群丰度的T-Test分析结果显示(图5),BCN样品中叉丝单囊壳属(Podosphaera)、Pseudoteratosphaeria属、Zymoseptoria属的丰度均明显高于BS样品(P < 0.05);而炭疽菌属(Colletotrichum)、节担菌属(Wallemia)、曲霉菌属(Aspergillus)、Graphiola属、黑孢属(Nigrospora)、青霉菌属(Penicillium)、梗孢酵母属(Sterigmatomyces)的丰度均明显低于BS样品(P < 0.05)。
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采用T-Test分析法分别对BCN和BS样品中桉树主要病害病原菌所属菌属的丰度进行比较。结果显示(表3),BS样品中引起桉树炭疽病的炭疽菌属丰度明显高于BCN样品(P < 0.05)。而BCN和BS样品中引起青枯病的假单胞菌属(Pseudomonas)、引起叶斑病类的叶点霉属和假尾孢属(Pseudocercospora)、引起花斑病的短梗霉属(Aureobasidium)、引起紫斑病的壳针孢属(Septoria)、引起枝枯病的毛色二孢属(Lasiodiplodia)、引起梢枯病的新壳梭孢属(Neofusicoccum)的菌群丰度则无显著差异。
菌属 Genus Freq1 Freq2 P值
P valueq值
q value效应量
Effect size95.0% 置信区间 95.0% CI 下限
Lower上限
UpperPseudomonas 40.534 71.146 0.071 1.000 −30.612 −64.790 3.566 Phyllosticta 0.081 14.517 0.059 1.000 −14.436 −29.774 0.903 Colletotrichum 0.005 0.020 0.046 1.000 −0.015 −0.029 0.000 Aureobasidium 0.000 0.009 0.115 1.000 −0.009 −0.021 0.003 Septoria 0.023 0.001 0.192 1.000 0.022 −0.017 0.062 Pseudocercospora 10.120 15.362 0.225 1.000 −5.242 −14.630 4.146 Lasiodiplodia 0.000 0.007 0.264 1.000 −0.007 −0.023 0.008 Neofusicoccum 0.083 0.033 0.267 0.990 0.050 −0.056 0.156 注:Freq1:桉树叶内菌属丰度;Freq2:油桐尺蛾中肠菌属丰度;q值:P值的校验值。
Note:Freq1: Abundance of bacteria or fungus in Eucalyptus leaves (genus level); Freq2: Abundance of bacteria or fungus inmidgut of Buzura suppressaria larvae (genera level); q value: The check value of the P value.Table 3. Comparison of abundance difference of Eucalyptus disease pathogenic bacteria in BCN and BS samples by T-Test (genus level)