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红桦(Betula albo-sinensis Burk.)是桦木科桦木属树种,为我国特有种,分布于陕西、甘肃、宁夏、青海、云南、四川、湖北、河北、河南、山西等地,垂直分布海拔为1000~3400 m。树高可达30 m,树皮为淡红褐色或紫红色,呈薄层状剥落,剥落树皮为纸质[1]。
红桦枝干挺拔,颜色亮丽,观赏价值高,可用于园林绿化;其独特的纸质树皮可用于工艺品制作以及包装行业,具有较高的经济价值;其木材质地坚韧,结构细密,可作优良的板材;适应能力强,亦可用做荒山造林树种,是我国北方高海拔地区重要的先锋造林树种,也是高山主要成林树种[2]。但由于20世纪70~80年代的大量砍伐,红桦原始林遭到了严重破坏,采伐后恢复起来的次生林,林分密度过大、质量不高,生产力低,各种生态和社会服务功能没有得到有效发挥,且红桦种子天然萌发对光照和昼夜温差要求较高,种子更新困难[3],因此,建立简单高效的红桦再生体系具有重要意义。
国外在桦树组织培养方面先后建立了纸桦(B.papyrifera Marshall)[4]、日本白桦(B. platyphylla var. Japonica)[5]、垂枝桦(B. pendula Roth.)[6]等桦树的组培再生体系;我国从20世纪70年代开始,亦已进行了白桦(B. platyphylla Suk.)[7]、光皮桦(B. luminifera H.Wink.)[8]、西南桦(B. alnoides Buch Ham.ex D.Don)[9]、裂叶垂枝桦[10]等桦木组织培养体系研究。
由于国内对于红桦组织培养方面的研究尚无,故本研究通过器官发生途径建立高效稳定的红桦组织培养技术体系,以期为红桦良种选育、定向培育及遗传转化等方面的研究提供理论支持,为高海拔地区荒山红桦造林提供技术支持,同时也可填补红桦无性繁殖研究方面的空白。
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高污染率、褐化死亡率及低萌发率极大地限制了植物组织培养体系的建立。由表1可以看出:灭菌剂处理时间不同,外植体接种后生长状态不同;随着0.1% HgCl2处理时间的延长,外植体的污染率呈现逐渐降低的趋势,但与此同时,由HgCl2自身引起的外植体褐化程度也逐渐加剧,当处理时间为8 min时,除去褐化及污染的影响,外植体萌发率达到所有处理中最高值,为60%。因此,综合上述3个指标,筛选出最适宜红桦外植体消毒灭菌的方法为:先用70%酒精消毒30 s,无菌水冲洗3~4次,然后用0.1% HgCl2消毒8 min,无菌水冲洗5~6次。
试验号
Test number灭菌时间/min
Sterilization time外植体数/个
Number of explants污染率/%
Pollution rate褐化死亡率/%
Browning mortality rate萌发率/%
Germination rateA1 4 60 51.7 ± 0.19a 6.7 ± 0.09a 41.7 ± 0.15a A2 6 60 45.0 ± 0.22b 15.0 ± 0.31ab 40.0 ± 0.18a A3 8 60 15.0 ± 0.25c 25.0 ± 0.27b 60.0 ± 0.32b A4 12 60 13.3 ± 0.17c 58.3 ± 0.19c 28.3 ± 0.44a 注:表中数据为平均值 ± 标准差,不同小写字母表示不同处理间差异显著(p < 0.05),下同。
Notes: The data in the table are the mean ± standard deviation, and different lowercase letters indicate significant differences between different treatments (p < 0.05), the same below.Table 1. Effects of 0.1% HgCl2 sterilization time on the acquisition of sterile explants
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初代培养结果(表2)表明:不同激素组合对休眠芽的萌发以及生长状态影响不同;当添加一定浓度的NAA时,随着6-BA浓度的增加,外植体的萌发率总体呈先上升后下降的趋势,当NAA浓度为0.1 mg·L−1、6-BA浓度为1.5 mg·L−1时,外植体萌发率达到最高,为83.33%,且此时外植体生长状态最佳,休眠芽在培养1周左右时开始萌发,叶片全部展开后茎也逐渐开始伸长生长;而当6-BA浓度一定时,NAA浓度升高,外植体萌发率逐渐下降,外植体生长状态无明显变化,当NAA浓度为0.2 mg·L−1时,所有处理下的外植体均不产生茎,平均萌发率也较添加0.1 mg·L−1 NAA时下降了10.61%。休眠芽初代培养过程中最主要的问题是只萌发展叶而不伸长生长,这样状态的外植体无法用于增殖以及生根培养。初代培养所有试验中,只有B4和B5处理下,外植体产生了茎,但B5诱导产生的茎较细弱,且叶片出现黄化现象,综合考虑,红桦休眠芽初代培养最佳激素配比组合为1.5 mg·L−1 6-BA+0.1 mg·L−1 NAA。
试验号
Test number植物生长调节剂浓度/(mg·L−1)
Concentration of plant growth regulator外植体数/个
Number of explants萌发率/%
Germination rate外植体生长状态
The growth state of the explants6-BA NAA IBA B1 0.8 0.1 0 30 53.33 ± 0.65 abc 基部无愈伤,无茎,叶皱缩 B2 1.0 0.1 0 30 56.67 ± 0.91 abc 基部无愈伤,无茎,叶破损发黄 B3 1.2 0.1 0 32 62.50 ± 0.34 abc 基部无愈伤,无茎,叶正常 B4 1.5 0.1 0 30 83.33 ± 0.55 d 基部有褐色疏松愈伤,茎健康,叶鲜绿 B5 1.8 0.1 0 28 71.43 ± 0.67 cd 基部有米黄色疏松愈伤,茎细弱,叶发黄 B6 2.0 0.1 0 28 72.41 ± 0.39 cd 基部有米黄色疏松愈伤,无茎,叶蜷曲发黄 B7 0.8 0.2 0 30 46.67 ± 0.44 abc 基部无愈伤,无茎,叶黄化 B8 1.0 0.2 0 32 56.25 ± 0.43 abc 基部无愈伤,无茎,叶破损发黄 B9 1.2 0.2 0 31 67.74 ± 0.58 bcd 基部有绿色紧实愈伤,无茎,叶黄化 B10 1.5 0.2 0 31 64.51 ± 0.71 bc 基部有绿色愈伤,无茎,叶皱缩 B11 1.8 0.2 0 29 62.07 ± 0.66 abc 基部有米黄色疏松愈伤,无茎,叶蜷曲发黄 B12 2.0 0.2 0 30 60.00 ± 0.80 abc 基部有米黄色疏松愈伤,无茎,叶黄化 B13 1.5 0.1 0.02 30 43.33 ± 0.63 a 基部产生绿色愈伤,无茎,叶正常 B14 1.5 0.1 0.05 30 50.00 ± 0.57 ab 基部产生绿色愈伤,无茎,叶正常 Table 2. Effects of plant growth regulators on primary culture
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将红桦带芽茎段接种到含有不同激素配比的增殖培养基中,培养约7 d茎段基部开始分化出芽点,周围产生绿色愈伤组织。培养40 d后的统计结果(表3)表明:增殖系数以及增殖苗健康指数均随6-BA浓度的升高呈先上升后下降的趋势,当6-BA浓度为1.5 mg·L−1时,增殖系数较1.0、2.0 mg·L−1浓度分别高出66.54%、62.37%,健康指数分别高出64.18%、46.67%,增殖情况最佳;随着NAA浓度增加,增殖系数和健康指数的变化趋势也表现为先上升后下降,在浓度为0.02 mg·L−1时,平均增殖系数为3.73,平均健康指数为1.75,均达到3个浓度处理中最高值。因此,红桦增殖培养最佳植物生长调节剂配比为1.5 mg·L−1 6-BA+ 0.02 mg·L−1 NAA,此处理下红桦增殖系数达到4.77,健康指数达到2.45。
试验号
Test number植物生长调节剂浓度/(mg·L−1)
Concentration of plant growth regulator增殖系数
Proliferation coefficient健康指数
Health index6-BA NAA C1 1.0 0.01 2.56 ± 0.15ab 1.28 ± 0.13a C2 1.0 0.02 3.04 ± 0.12ab 1.24 ± 0.09a C3 1.0 0.05 2.57 ± 0.32ab 1.51 ± 0.22a C4 1.5 0.01 4.45 ± 0.21ab 2.16 ± 0.32a C5 1.5 0.02 4.77 ± 0.18a 2.45 ± 0.14a C6 1.5 0.05 4.37 ± 0.22ab 1.99 ± 0.25a C7 2.0 0.01 2.67 ± 0.41ab 1.64 ± 0.23a C8 2.0 0.02 3.39 ± 0.24ab 1.55 ± 0.16a C9 2.0 0.05 2.30 ± 0.21b 1.32 ± 0.26a Table 3. Effects of plant growth regulators on the proliferation culture
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生根培养约7 d,外植体基部可见嫩根生出,生根培养过程中也伴随着壮苗效果,组培苗的长 势逐渐变好,茎变粗,叶片变大且颜色由淡绿变为翠绿。培养25 d不同基本培养基以及不同浓度IBA对生根的影响见图1,3种不同基本培养基下的平均生根率(图1A)高低次序依次为:1/2 MS >WPM > MS,1/2 MS培养下的平均生根率为84.9%, 为MS培养的2.6倍;虽然1/2 MS培养下红桦生根率最高,但其平均生根条数(图1B)、根长(图1C)、生根指数(图1D)均小于WPM培养下生根苗的相应指标,分析根健康指数(图1E),WPM培养下根健康指数平均为1.77,高于另外2种基本培养基,生根苗也更易移植成活,因此,红桦最佳生根基本培养基为WPM。
Figure 1. Effects of basic medium type and IBA concentration on the induction of adventitious roots of Betula albo-sinensis
不同浓度IBA处理的平均生根率高低次序为:0.8>1.0>0.5>0.4 mg·L−1,分别为75.8%、74.2%、73.3%、14.67%,可看出IBA浓度与生根率先呈正相关,在0.8 mg·L−1时生根率达最高值,而当浓度升至1.0 mg·L−1时,生根率则有所下降。综合考虑生根率及无根单株生根状态,即生根数、根长、健康指数及生根指数,得出以WPM为基本培养基,附加0.8 mg·L−1 IBA时生根效果最佳,此处理下生根率达到100%,健康指数也高达2.61。
蔗糖浓度对生根培养的影响见表4,生根率随蔗糖浓度的升高而逐渐增加,当浓度超过25 g·L−1时,各处理间的差异并不显著。在浓度为30、35 g·L−1时均达到了100%的生根率,但在30 g·L−1蔗糖的处理下,平均生根条数、根长、生根指数、健康指数均高于35 g·L−1的处理,表明红桦生根培养添加最适蔗糖浓度应为30 g·L−1。
试验号
Test number基本培养基
Basic medium蔗糖浓度/(g·L−1)
Concentration of Sucrose生根率/%
Rooting rate平均生根数/条
Mean rooting number根长/cm
Root length生根指数
Rooting index健康指数
Health indexE1 WPM 20 72 ± 3.09 b 3.06 ± 0.21 b 4.21 ± 0.40 a 9.28 ± 0.62 b 2.11 ± 0.15 a E2 25 96 ± 2.54 a 3.25 ± 0.19 ab 4.52 ± 0.29 a 14.10 ± 0.84 a 2.17 ± 0.09 a E3 30 100 ± 0.00 a 4.24 ± 0.35 a 5.01 ± 0.33 a 21.62 ± 0.66 a 2.44 ± 0.22 a E4 35 100 ± 0.00 a 3.84 ± 0.31 ab 4.33 ± 0.25 a 16.63 ± 0.58 a 2.20 ± 0.27 a Table 4. Effects of sucrose concentration on rooting culture
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组培瓶苗移植第2天开始原有叶片开始逐渐萎蔫掉落,第7天开始从侧芽处萌发新叶,第14天左右结束缓苗,植株长势逐渐恢复,叶片逐渐变大且颜色变翠绿,茎也变粗壮且逐渐木质化,21 d统计移植成活率为83.9%。