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薄壳山核桃(Carya illinoensis (Wangenh.) K. Koch)属胡桃科(Juglandaceae)山核桃属(Carya),又称碧根果、长山核桃、美国山核桃,自然分布于美国和墨西哥北部,为一种多年生高大落叶乔木。现以美国为产业中心,分为东南、中南、西南和北部四大商业化产区,涵盖全美24个州[1]。薄壳山核桃是典型的果材兼用型树种。其坚果产量高、壳薄个大、营养丰富,是大众颇为喜爱的保健食品;种仁含油量高达70%以上,不饱和脂肪酸超97%,优于茶油、花生油等,是世界重要的木本油料植物[1-3]。薄壳山核桃因其世代周期长、树形优美、树势挺拔,也是重要的景观绿化树种;其木材结构细密、坚固强韧、纹理美观,可用于军工、建筑以及制作高档家具和工艺品,属于珍贵用材树种[1-3]。
我国引种薄壳山核桃已有百年历史,前期主要引进种子及苗木,后期开始引进系列良种,并进行自主选育与栽培推广。据不完全统计,近年来江苏、浙江、安徽、四川、云南等省份陆续引进和保存的薄壳山核桃品种超过100个[4],相继审(认)定的良种超过40个,包括美国引进与自主选育的品种[5]。但薄壳山核桃品种选育多利用种子繁殖,后代变异大且童期较长,目前栽培推广的大多仍是从美国引进的品种。由于薄壳山核桃品种引进均为种条,形态相似难以区分,且前期引种历史较长、引种程序不规范,各地间相互频繁引种难免造成品种间相互混杂混淆,甚至直接改换国外品种名称,造成同物异名或同名异物的现象经常发生,这也给薄壳山核桃品种种质评价、遗传改良以及面上推广工作带来极大的不便。因此,对薄壳山核桃品种进行准确的评价与鉴定,不仅有助于保护林木植物新品种权、保障所有权人的利益,而且能从根本上保证我国薄壳山核桃产业的商业化发展。
分子标记技术不受外界环境及人为因素的影响,可直接反映不同个体间DNA水平上的差异,实验过程简便快捷、结果稳定可靠,已广泛应用于林木遗传学及基因组学的各个领域。在薄壳山核桃亲缘关系分析与品种鉴定方面,前期已有RAPD[6-8]、ISSR[9]、SRAP[10]、SSR[11-12]、SNP[13]、DNA条形码[14]和叶绿体基因组[15-16]等众多标记的研究。与显性标记相比,SSR标记在基因组中各个区域广泛分布、数量极大、变异丰富,且为共显性遗传,是目前使用最广泛的一种分子标记[17],尤其是结合荧光标记高通量基因分型技术,已成功应用于杨树[18]、柳树[19]、栎树[20]、刺槐[21]、含笑[22]、桂花[23]等多个木本植物指纹图谱的构建研究。国内薄壳山核桃分子生物学的研究起步较晚,在指纹图谱构建方面尚未见相关报道。鉴于此,本研究选取薄壳山核桃及其近缘种开发的SSR标记,经筛选后利用荧光标记并对25个美国引进品种进行基因分型,用以构建指纹图谱并分析其亲缘关系,旨在建立一种快速、稳定、可靠的薄壳山核桃基因分型体系,为薄壳山核桃品种改良工作提供有益参考,同时也为薄壳山核桃遗传资源的鉴定与品种保护提供理论依据。
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本研究所用25个薄壳山核桃品种均从美国引进,定植于江苏省句容市南京林业大学薄壳山核桃种质资源圃内(表1)。采集所有品种幼嫩叶片,利用试剂盒(天根生化科技有限公司,DP305)按说明书步骤提取叶片总DNA。分别使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测总DNA的完整性、纯度与浓度。
编号
Code品种
Variety遗传背景
Genetic background雌雄异熟类型
Dichogamy type1 ‘Cape Fear’ ‘Schley’ 自由授粉子代 Open pollination progeny of ‘Schley’ 雄先型 Protandrous 2 ‘Choctaw’ ‘Success’ × ‘Mahan’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Success’ × ‘Mahan’ 雌先型 Protogynous 3 ‘Desirable’ ‘Russell’ × ‘Success’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Russell’ × ‘Success’ 雄先型 Protandrous 4 ‘Elliott’ 实生苗 Seedling 雌先型 Protogynous 5 ‘Forkert’ ‘Success’ × ‘Schley’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Success’ × ‘Schley’ 雌先型 Protogynous 6 ‘Gloria Grande’ ‘Stuart’ 子代 Seedling of ‘Stuart’ 雌先型 Protogynous 7 ‘Hirschi’ 实生苗 Seedling 雄先型 Protandrous 8 ‘Jackson’ ‘Success’ × ‘Schley’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Success’ × ‘Schley’ 雄先型 Protandrous 9 ‘Kanza’ ‘Major’ × ‘Shoshoni’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Major’ × ‘Shoshoni’ 雌先型 Protogynous 10 ‘Kiowa’ ‘Mahan’ × ‘Desirable’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Mahan’ × ‘Desirable’ 雌先型 Protogynous 11 ‘Mahan’ ‘Schley’ 实生苗 Seedling of ‘Schley’ 雌先型 Protogynous 12 ‘Major’ 实生苗 Seedling 雄先型 Protandrous 13 ‘Mandan’ ‘BW-1’ × ‘Osage’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘BW-1’ × ‘Osage’ 雌先型 Protogynous 14 ‘Mohawk’ ‘Success’ × ‘Mahan’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Success’ × ‘Mahan’ 雌先型 Protogynous 15 ‘Nacono’ ‘Cheyenne’ × ‘Sioux’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Cheyenne’ × ‘Sioux’ 雌先型 Protogynous 16 ‘Navaho’ ‘Apalachee’ × ‘Wichita’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Apalachee’ × ‘Wichita’ 雄先型 Protandrous 17 ‘Oconee’ ‘Schley’ × ‘Barton’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Schley’ × ‘Barton’ 雄先型 Protandrous 18 ‘Pawnee’ ‘Mohawk’ × ‘Starking Hardy Giant’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Mohawk’ × ‘Starking Hardy Giant’ 雄先型 Protandrous 19 ‘Schley’ 实生苗 Seedling 雌先型 Protogynous 20 ‘Shoshoni’ ‘Odom’ × ‘Evers’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Odom’ × ‘Evers’ 雌先型 Protogynous 21 ‘Sumner’ ‘Schley’ 实生苗 Seedling of ‘Schley’ 雌先型 Protogynous 22 ‘Surprize’ 实生苗 Seedling 雄先型 Protandrous 23 ‘Tejas’ ‘Mahan’ × ‘Risien #1’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Mahan’ × ‘Risien #1’ 雌先型 Protogynous 24 ‘Western’ ‘Longfellow’ 实生苗 Seedling of ‘Longfellow’ 雄先型 Protandrous 25 ‘Wichita’ ‘Halbert’ × ‘Mahan’ 杂交子代 Hybrid progeny of ‘Halbert’ × ‘Mahan’ 雌先型 Protogynous Table 1. Experimental materials
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从前期已发表的薄壳山核桃及其近缘种SSR标记中挑选54对通用性较高的引物,并随机选择16个品种为模板进行引物初筛。经高分辨率琼脂糖凝胶电泳检测,最终确定10对SSR标记用于后续分析(表2)。用荧光基团标记所有引物前项5′端,交由生物公司进行合成。
编号
Code位点
Locus前项引物
Forward primer后项引物
Reverse primer基序
Motif参考文献
Reference1 PM-CIN4 GGCATCAGAGAAGGCTCCT CTCACCCGTCTCTAGGGCTA (CTT)12 [11] 2 PM-GA31 TGAACTCCAAAAGCCTCCTCTC GTATTTGTATTTTTTCCTTGAGCTTTCTC (CT)12 [11] 3 PM-GA38 AAAAGTTTTAGGGTTGTTTGCTCTCT GTAAAGCCTACAACCTACAACAGTCTATG (CT)12 [11] 4 PM-GA41 TCTTCAGAAAAAACCCTTACCTCTCT GAAAAATATAAACTCCCATACTACCCACAT (CT)9 [11] 5 Cc19 AAACCTTGGCATAGTCATTTGAGA GCTTTGTCAACTTTGTTTTGGGTGT (TC)8 [24] 6 Cc4 GCTCCAAGCGAAAGTCAAGT TCATAAACCAACGCCAAAGA (TC)6 [24] 7 WGA70 TGTAATTGGGGAATGTTGCA TGGGAGACACAATGATCGAA (GA)14 [25] 8 BFU-Jr19 CAGAAAGCACGTGAACCAGA AACACTCACGCACCTTCATTT (TA)10 [26] 9 BFU-Jr82 TTGCCTCTCTATAGGCTTTTTAGC TGAGTGTCTGGACAGCAAGG (CT)7 [26] 10 Zm26 TTCTTCGTCCATACCCACC ACCCCATTAGCGACCTTTA (TC)22 [27] Table 2. Details of 10 SSR primer pairs
采用10 μL PCR反应体系进行引物初筛,包含1 μL DNA模板,各0.4 μL前后项引物,5 μL PCR Mix(上海生工Taq PCR Mix 预混液,2 ×,含蓝染料),3.2 μL ddH2O。PCR扩增程序按以下步骤进行:首先94℃预变性4 min;然后94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,循环35次;最后72℃延伸10 min。
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基因分型PCR反应为25 μL体系,包含1 μL DNA模板,各1 μL前后项引物,1 μL dNTP,2.5 μL Taq Buffer(含MgCl2),0.5 μL Taq酶,18 μL ddH2O。PCR扩增程序按以下步骤进行:首先95℃预变性3 min;其次94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环10次;随后94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环35次;最终72℃延伸8 min。PCR产物中加入HiDi与LIZ 500内标,经98℃变性5 min后迅速移至冰上进行冷却,随后放置于ABI 3730 XL全自动DNA测序仪内进行电泳检测。
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利用测序仪自带的Genemapper软件统计各位点基因分型数据;使用MSA软件计算各位点等位基因数(A)和多态信息含量(PIC)等数据;使用NTSYS-pc软件中Qualitative data模块计算两两个体间遗传相似系数(GS):GS = 2Nij /(Ni + Nj),式中:Nij为i和j共有的谱带数,Ni和Nj为i和j个体的谱带数,以clustering程序中SHAN进行非加权组平均法(UPGMA)聚类。
1.1. 试验材料与DNA提取
1.2. 引物筛选与通用性检测
1.3. 基因分型体系建立
1.4. 数据分析
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以25个薄壳山核桃品种为模板,检验10对荧光SSR标记多态性情况。表3表明 :10对SSR标记共扩增出68条等位片段,平均6.8个,其中,位点BFU-Jr19扩增的等位基因数最少(3个),位点Cc19扩增的等位基因数最多(12个)。10个SSR标记的多态信息含量(PIC)的变化范围为0.291 0~0.843 5,平均0.588 3,其中,位点Cc19的PIC值最高,位点BFU-Jr82的PIC值最低。图1为位点PM-CIN4在部分薄壳山核桃品种中的基因分型结果。
位点
Locus等位基因数
No. of allele等位基因长度
Length of allele/bp多态信息含量
PICPM-CIN4 9 89~143 0.763 2 PM-GA31 10 84~112 0.733 4 PM-GA38 6 82~98 0.681 5 PM-GA41 4 82~88 0.437 3 Cc19 12 86~120 0.843 5 Cc4 6 185~197 0.467 7 WGA70 6 173~195 0.644 3 BFU-Jr19 3 272~290 0.343 0 BFU-Jr82 5 271~289 0.291 0 Zm26 7 201~219 0.678 5 合计 Total 68 平均 Average 6.8 0.588 3 Table 3. Polymorphism detection of the 10 pairs of SSR markers
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对10个SSR位点扩增的等位片段做进一步统计分析,经不同标记间相互组合,最终确认4对核心引物的组合可用于25个薄壳山核桃品种指纹图谱的构建。表4表明:标记Cc19可以区分11个品种,标记PM-GA31能区分10个品种,标记PM-CIN4能区分6个品种。通过引物Cc19、PM-GA31与PM-CIN4的组合可区分21个薄壳山核桃品种,加入标记PM-GA41后,4对引物组合可完全区分薄壳山核桃的25个品种。
品种
Varieties核心引物 Core primers PM-CIN4 PM-GA31 PM-GA41 Cc19 ‘Cape Fear’ 107/143 102 84/86 118 ‘Choctaw’ 131/143 98/100 84/86 118 ‘Desirable’ 131/143 98 84/86 108/116 ‘Elliott’ 110/143 94/102 84/86 98/118 ‘Forkert’ 107/143 102 84/86 96/98 ‘Gloria Grande’ 107 94 82/88 88 ‘Hirschi’ 104/107 94 84/86 94/96 ‘Jackson’ 92/107 94 84/86 96/98 ‘Kanza’ 107/143 94 84/86 96/118 ‘Kiowa’ 104/107 94 86 94/96 ‘Mahan’ 107/143 94 84/86 98 ‘Major’ 110/143 84/86 84/86 88/96 ‘Mandan’ 89/131 84/88 86/88 92/98 ‘Mohawk’ 92/107 94 84/86 94/98 ‘Nacono’ 92/113 94 84/86 98/118 ‘Navaho’ 107/131 94 86 96/120 ‘Oconee’ 107/143 102 84/86 116/118 ‘Pawnee’ 110/143 88 84/86 114/116 ‘Schley’ 92/107 92/94 84/86 94/98 ‘Shoshoni’ 92/107 86/88 86 86/116 ‘Sumner’ 131/143 96/98 86 108/116 ‘Surprize’ 107/128 84 84/86 96/100 ‘Tejas’ 92/143 88 86 94/96 ‘Western’ 92/107 94 86 94/98 ‘Wichita’ 110/143 112 84/86 94 Table 4. Fingerprint of 25 varieties of Pecan
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计算各品种间遗传相似系数,并按UPGMA法进行聚类(图2)。25个薄壳山核桃品种间遗传相似系数在0.62~0.99之间,并聚类成2个大的类群。
第一个大的类群包含9个薄壳山核桃品种,其中,‘Schley’自由授粉子代‘Cape Fear’与‘Schley’杂交子代‘Oconee’聚成一个小的分枝,并与品种‘Choctaw’聚在一起,而‘Choctaw’的一个亲本‘Mahan’也是‘Schley’实生子代。其他品种如‘Mandan’、‘Nacono’、‘Tejas’和‘Shoshoni’因杂交亲本差异较大,各品种间的亲缘关系也相对较远。第二个大的类群包含16个薄壳山核桃品种,其中,来源于实生苗的品种‘Hirschi’与‘Kiowa’亲缘关系较近;品种‘Mohawk’、‘Schley’、‘Western’和‘Jackson’聚类成一个小的分枝,其中‘Mohawk’一个亲本为‘Mahan’,而‘Mahan’也是‘Schley’实生子代;‘Western’又名‘Western Schley’,虽然来源于实生苗选育,但其性状与‘Schley’极为相似;而‘Jackson’为杂交选育,其中的一个亲本即为‘Schley’。其余几个品种如‘Navaho’、‘Wichita’和‘Pawnee’虽然亲缘关系相对较远,但追溯其亲本来源,均与品种‘Schley’相关。