Differential Analysis of Anther Embryogenesis between Different Genotypes of Hevea brasiliensis

以国家橡胶树种质资源圃（海南省儋州市宝岛新村）保存的32个橡胶树品种为材料（表1）。于春季3月份采集黄中带绿、未开放的雄花（花粉发育处于单核靠边期），用75%乙醇表面灭菌60 s后，立即用0.1%HgCl₂处理10 min，最后用无菌水冲洗5次，每次3 min^[14]。表面灭菌后的雄花用于后续愈伤组织诱导和体胚发生研究。

改良MS培养基用于愈伤组织诱导和体胚发育，其中，大量元素、微量元素、铁盐所需的药品和蔗糖购自广州化学试剂厂；有机营养、植物激素和生长调节剂采购于上海生物工程技术有限公司和Sigma-Aldrich公司；植物凝胶采购于Sigma-Aldrich公司。

花药愈伤组织诱导采用平底试管为培养容器。体胚分化阶段采用培养皿作为培养容器。

参考《中国橡胶树育种五十年》并参考相关文献[28-30]信息，整理参试品种亲本并进行系谱分析。

首先将雄蕊从雄花中剥出，然后接种到愈伤组织诱导培养基上（M培养基和S培养基），每个品种每处理接种数量超过120粒花药，重复3次，26 ℃～28 ℃暗室中培养40 d～60 d。形成愈伤组织后，将花药愈伤组织接种到体胚发生培养基上（E培养基），于24～26 ℃暗室中培养40～60 d。M培养基为改良MS添加4.6 μmol·L⁻¹ ZT，4.1 μmol·L⁻¹ Picloram，4.5 μmol·L⁻¹ 2,4-D。S培养基为改良MS添加2.3 μmol·L⁻¹ KT，2.1 μmol·L⁻¹ Picloram，2.3 μmol·L⁻¹ 2,4-D。E培养基为改良MS添加2.2 μmol·L⁻¹ 6-BA，14.0 μmol·L⁻¹ KT，1.4 μmol·L⁻¹ GA₃，0.1 μmol·L⁻¹ NAA，3.8 μmol·L⁻¹ ABA^[15]。以上培养基均添加204.5 mmol·L⁻¹蔗糖，2.2 g·L⁻¹ Phytagel，灭菌前调整pH至5.8。

愈伤组织形成率= 形成愈伤组织的雄蕊数/接种雄蕊总数 × 100%。

体细胞胚形成率= 形成体细胞胚的愈伤组织数/接种愈伤组织总数 × 100%。

子叶形体细胞胚形成率= 形成子叶形体细胞胚的愈伤组织数/接种愈伤组织总数 × 100%。

试验结果采用SPSS的Ducan法进行差异性分析。

体胚苗倍性鉴定用Sysmex Cy-Flow^®Cube8流式细胞仪进行。鉴定方法参考仪器附送试剂使用方法（http://www.sysmex-partec.com），即取200 mg新鲜叶片置于塑料培养皿中，添加0.5 mL裂解缓冲液，用刀片快速切碎，30 μm孔径滤网过滤，添加1.6 mL DAPI染色体液，室温静置30 s后上机检测。每株体胚苗随机取1片叶片进行检测。流式数据使用机器自带软件作图。以已知二倍体和三倍体植株叶片混合检测作图为对照。

根据亲本来源，对国家橡胶树种质资源圃保存的32个橡胶树品种进行系谱分析，试验所用32个橡胶树品种分别属于初生代无性系、次生代无性系、三生代无性系和四生代无性系（图1）。PR107、GT1、PB86、Tjirl、海垦1、天任31-45、合口3-11这7个品种为初生代无性系，其余25个品种中的23个与以上7个初生代无性系中的1～3个存在亲缘关系，表明我国橡胶树栽培品种亲本来源狭窄。此外，图1系谱中，含初生代无性系遗传背景的后代中，以含PR107亲本的后代最多，共有14个，以PR107为父本的品种有GT1、93-114、RRIM513、PB86、RRIM600、海垦1共6个母本组。

Figure 1.  Pedigree analysis of rubber tree and analysis of differences in anther embryogenic ability

橡胶树花药愈伤组织、体细胞胚和体胚苗的诱导过程见图2。参试32个品种均能诱导出愈伤组织，多数品种在M培养基和S培养基上的愈伤组织诱导率接近，其中，31个品种的愈伤组织形成率均达50%以上(表1)，表明所试愈伤组织诱导培养基在橡胶树花药愈伤组织诱导中具有广谱性。

Figure 2.  The Induction process of anther somatic embryo plantlet of rubber tree

愈伤组织转移到诱导体胚发生的E培养基后，来自M培养基和S培养基诱导的愈伤组织在大多数品种上体细胞胚诱导率较接近，只有个别品种存在显著性差异。23个品种能够诱导形成体细胞胚，且有14个品种能够诱导形成子叶形体细胞胚和体胚苗，其中，热研73397、热研88-13、热垦525和徐育3这4个品种的体细胞胚诱导率在50%以上，说明所试体胚发生培养基在橡胶树体胚发生中具有通用性，但仍有14个品种的体细胞胚诱导率在10%以下，且有9个品种未能诱导出体细胞胚（表1）。

根据品种体胚诱导能力，将体胚诱导率<10%的品种定义为难诱导品种，体胚诱导率在≥10%且≤20%的品种定义为可诱导品种，体胚诱导率>20%的品种定义为易诱导品种（图1）。7个初生代无性系中，GT1、PR107、天任31-45、Tjirl属于难诱导品种，合口3-11属于可诱导品种，PB86和海垦1属易诱导品种。12个次生代无性系中，云研77-2、云研77-4、云研73-46、保亭1-285、93-114、RRIM513、IAN873属于难诱导品种，RRIM600、文昌217属于可诱导品种，大丰95、海垦2^[5,17]、徐育141-2属于易诱导品种。10个三生代无性系中，湛试32713、热研217、保亭3412属于难诱导品种，大丰117、文昌11属于可诱导品种，PB235、徐育3、热研917（热研7-20-59）、热研73397、热研88-13属于易诱导品种。4个四生代无性系中，热垦628属于可诱导品种，热垦525、热研879、热研918（热研8-333）属于易诱导品种。分析发现，已知体胚诱导率的初生代、次生代、三生代和四生代无性系中难诱导体胚发生品种占比分别为57.1%、58.3%、30.0%、0.0%。

亲本诱导能力决定其子代品种体胚诱导能力。2个亲本属于难诱导品种，其杂交后代多数为难诱导品种，如GT1 × PR107、93-114 × PR107、RRIM513 × PR107这3个杂交组合的后代有7个，6个为难诱导品种，只有1个为可诱导品种；1个亲本为难诱导品种，另1个为易或可诱导品种，其杂交后代多数属于易或可诱导品种，如PB86 × PR107、Tjir1 × PB86、海垦1 × PR107、天任31-45 × 合口3-11、RRIM600 × PR107、IAN873 × PB235、热研88-13 × 热研217这7个杂交组合的后代有12个，其中，7个品种属于易诱导品种，4个品种为可诱导品种，只有1个品种为难诱导品种。

具有相同亲本的橡胶树品种体细胞胚诱导率差异显著，且存在超亲现象。RRIM600 × PR107子代热研73397、热研917和文昌11三个品种中，热研73397的体胚诱导率和子叶形体胚诱导率分别为95.0±5%、23.1±8.2%，显著性高于热研917（47.6±19%、0.6±1%）、文昌11（11.5±2.2%、0.6±1%）和双亲；海垦1 × PR107子代徐育141-2和文昌217中，徐育141-2的体胚诱导率和子叶形体胚诱导率（48.1±34.2%、13.3±10.4%）显著性高于文昌217（17.6±1.2%、0）和双亲；RRIM513 × PR107子代热研217和大丰117中，热研217的体胚诱导率为零，而大丰117在M培养基上体胚诱导率达到15.6±0.7%，且显著性高于双亲；GT1 × PR107子代云研77-2、云研77-4、云研73-46和保亭1-285四个品种中，只有云研73-46在所试培养基上能够诱导得到体胚。

流式细胞仪倍性检测结果（图3和表2）表明：混合已知二倍体和三倍体植株叶片DNA相对含量在200和300位置均有波峰作为对照（图3A），二倍体的DNA相对含量为200（图3B），三倍体植株为300（图3C），流式细胞仪倍性检测可以准确鉴定出橡胶树体胚苗的倍性。

Figure 3.  Flow cytometric analysis

橡胶树不同基因型体胚苗倍性鉴定统计结果见表2，从15个品种共552株体胚苗倍性鉴定结果看，不同基因型体胚苗同其母本倍性一致，证明多基因型花药体胚苗来源于体细胞。

目前，未有深入开展橡胶树多基因型体胚发生能力研究的报道，在检索的少量研究报道中，橡胶树品种热研879花药体细胞胚诱导率为10%～14%，RRIM600为11%～49%，热垦525为51%左右，热研73397为21%左右，都属于易或可诱导体细胞胚品种；云研77-2、云研77-4、云研73-46、GT1和PR107花药体细胞胚诱导率都在10%以下，甚至为0，都属于难诱导体细胞胚品种，与本研究结果一致^[17-23]。本研究的32个橡胶树品种中，有18个品种的体细胞胚诱导率在10%以上，有14个品种能够诱导得到子叶形体细胞胚，其中，热研73397的体细胞胚诱导率最高达95%，热研879的最高达32%以上，显著高于前人的研究结果。

Hodges等发现，在相同的培养条件下，玉米A188自交系的体细胞再生能力显著高于其他品系，以其作为亲本与无再生能力的自交系进行杂交，杂交后代具有再生能力；另外以两个再生能力差的自交系进行杂交，杂交后代再生能力也差，表现出不同基因型玉米的体细胞再生能力有较大差异且可遗传^[31]。Parrott等发现，基因型对大豆体细胞胚发生能力有很大影响，有良好再生能力的品系在其系谱中都有一个或两个高再生能力的祖先亲本，且高再生能力基因型与低再生能力基因型的杂交F1代表现出中等再生能力，表明大豆体细胞再生能力可遗传^[32]。Niskanen等发现，父本和母本的基因型对欧洲赤松体细胞胚发生都有影响，在胚性组织起始诱导阶段，母本的影响大于父本，在胚性组织长期继代增殖阶段，父本的影响相对母本增加^[33]。在遗传变异对甜根子草胚性愈伤组织诱导和再生能力研究中发现，愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导能力受遗传变异显著影响，而胚性愈伤组织的再生频率不受遗传变异影响，愈伤组织诱导能力与胚性愈伤组织诱导能力及再生频率密切相关，表明不同基因型的胚性愈伤组织诱导和再生频率能够基于愈伤组织诱导能力进行预测^[34]。在橡胶树体细胞胚发生方面，前人开展了部分品种的花药体细胞胚发生研究，发现不同品种间的体细胞胚发生能力存在显著差异^[17-23]。本研究通过对32个橡胶树品种的花药愈伤组织和体细胞胚诱导情况进行分析，发现橡胶树愈伤组织诱导能力不存在明显的基因型影响，而体细胞胚发生能力存在明显的基因型影响；对于橡胶树不同品种来说，子代的体细胞胚形成率与亲本体细胞胚发生能力相关，父本和母本均影响子代体细胞胚发生能力，至少含一个易于诱导或可诱导亲本，子代才易于或可诱导体胚，表明橡胶树体细胞胚发生能力可遗传。另外本研究发现，已知体胚诱导率的初生代、次生代、三生代和四生代无性系中难诱导体胚发生品种占比依次减少，推测随着易诱导亲本与难诱导亲本的杂交，后代中易诱导体胚发生品种有逐渐增多的趋势。

Gawel等将能产生体细胞胚的棉花品种与不能产生体细胞胚的品种进行杂交，分析了后代的体细胞胚发生能力，统计结果表明棉花体细胞胚发生是由多基因参与控制的^[35]。叶兴国等选用13个小麦亲本基因型及其F1代进行花药培养，发现小麦花药培养力的遗传控制非常复杂，表现为多基因控制的数量性状遗传^[36]。何平等用同一种培养基培养籼粳杂交F1代群体110个株系的花药，结果表明水稻花药培养力是由多基因控制的^[37]。张晓玲等对来源于美国、墨西哥和中国的144份不同玉米自交系幼胚胚性愈伤组织的再生能力相关性状进行研究，结果表明玉米幼胚培养性状的遗传变异受多基因调控^[38]。本研究发现，具有相同亲本的橡胶树品种体细胞胚诱导率差异显著，且存在超亲现象，表明橡胶树体细胞胚发生能力的遗传控制复杂，推测橡胶树体细胞胚发生也是由多基因参与控制的。

Hargreaves等改进了胚性细胞系的启动和早期增殖方法，在20个控制授粉的辐射松合子胚培养中得到成功应用，显著好于以前结果，表明有可能通过改进培养条件，打破遗传背景的影响^[39]。李健英等经过连续再生驯化（SRA）的方法提高了棉花再生和转化效率，并在非胚性愈伤组织时期外施DNA甲基化抑制剂促进了体细胞胚发生^[40]。王轲等通过在小麦中过表达再生基因TaWOX5，显著提高了小麦组织培养再生植株和转化效率，促进了质量较差愈伤组织的分化，基本克服了基因型依赖，而且未出现过表达WUS2和BBM等再生基因时出现的影响愈伤组织分化和根系生长或导致畸形植株的弊端，同时该基因在大麦、小黑麦、黑麦、玉米中的再生和转化作用也得到了验证^[41]。本研究中多个橡胶树品种的体细胞胚诱导率显著高于前人的研究结果，推断得益于培养基改进。

在目前栽培的主要橡胶树品种中，含PB86、RRIM600、热研88-13和海垦1等亲本的后代基本为容易或可诱导体胚的品种类型；含GT1、天任31-45、93-114和RRIM513等亲本的后代体胚诱导率较低；含PR107亲本的后代体胚诱导难易均有，当其后代亲本中不含易或可诱导亲本遗传基础时，后代体胚诱导率低，如母本中含GT1、93-114和RRIM513等亲本的PR107后代体胚诱导率低，当其后代亲本中含有易或可诱导亲本时，后代体胚诱导率高，如母本中含PB86、RRIM600和海垦1等亲本的PR107后代基本为容易或可诱导体胚的品种类型。本研究结果为今后橡胶树体胚发生培养体系的优化指明了方向，可以按亲本进行分组，进一步优化体胚培养条件，如含PB86、RRIM600、热研88-13和海垦1等遗传基础的后代可在现有培养条件的基础上进一步优化，得到适宜培养条件，如含GT1、天任31-45、93-114和RRIM513等遗传基础的后代需在现有培养条件基础上进行大幅度的调整和优化，如从外植体选择与处理、基本培养基筛选、新药品探索、连续再生驯化、过表达再生基因等更多方向开展试验。同时本研究结果可以为橡胶树的传统杂交育种提供参考，以性状优良且体胚诱导率高的橡胶树品种为亲本配置杂交组合，获得高体胚诱导率的优良子代几率大，也为高产高抗无性系优质种苗的工厂化生产和转基因育种研究提供了基础。

本研究通过对32个橡胶树品种的遗传关系和体胚发生能力进行比较分析，发现体胚诱导率存在显著的基因型差异，且这种差异可遗传。依据体胚诱导率和遗传关系，将亲本的诱导率同子代的诱导率结合进行分析并分组，为通过基因型分组优化橡胶树多品种体胚发生提供了依据。结果表明，亲本PB86、RRIM600、热研88-13和海垦1及其后代可按本研究所采用的培养条件进行小幅度优化，得到更适合的培养条件；亲本GT1、天任31-45、93-114和RRIM513及其后代需要在现有培养条件基础上进行大幅度的优化，以明确其培养条件。本研究中多个橡胶树品种的体细胞胚诱导率显著高于前人的研究结果。另外，本研究通过对15个品种的体胚苗进行倍性鉴定，证明不同基因型花药体胚苗均来源于体细胞。