-
固氮菌是森林生态系统中重要的功能菌群,它通过固氮酶的作用把大气中分子态氮还原为植物可利用态氮[1-2],为植物生长提供氮素营养。固氮菌在森林生态系统氮循环,尤其是土壤氮循环中具有重要作用,其群落多样性及结构组成是土壤氮素固定及维持氮循环平衡的重要指标 [3-4]。研究森林土壤固氮菌群落多样性及组成可对提高土壤氮素水平和森林土壤氮循环机理提供新认识,可为森林植被恢复和森林经营提供科学依据。
已有研究表明固氮菌群落与植被类型、土壤特性等因素有互作效应[5-7]。植物群落通过凋落物和根系分泌物等影响固氮菌的种类和丰度,而固氮菌通过改变土壤环境、土壤养分矿化等方式影响植物群落[8]。Templer 研究表明不同树种土壤氮保留能力显著差异[9],并且在不同植被类型下土壤固氮菌群落存在显著差异[10]。土壤中的碳、氮含量及碳氮比显著影响土壤固氮菌的活性及分布[5,7,11-13]。相较传统研究方法,高通量测序技术由于其精确性而被广泛应用于微生物的研究中[14-15],对于高通量测序检测土壤固氮菌通常选用nifH作为分子标记基因,因其是编码铁蛋白组分的基因且高度保守,在固氮微生物中都可以检测到[16]。
北半球温带森林在调节全球碳平衡和减缓全球气候变化进程中扮演着重要角色[17-19],华北地区是我国暖温带落叶阔叶林的重要分布区域,北京松山自然保护区是华北地区内保持完好,植被类型典型且丰富的自然保护区之一[20],油松林(Pinus tabuliformis Carriere.)是保护区最具代表性的植被类型,区内还分布有核桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)、山杨(Populus davidiana Dode.)、白桦(Betula platyphylla Suk.)、蒙古栎(Quercus mongolica Fisch.)等常见暖温带落叶阔叶林[21]。目前已有对该地区不同林分类型下土壤细菌和真菌的研究报道[22],然而对不同林分下土壤固氮微生物群落特征及其与土壤理化性质之间相互关系的研究未见报道。
本研究以北京松山国家级自然保护区内4种典型林分(油松林、针阔混交林、蒙古栎林、核桃楸林)下土壤为研究对象,以固氮酶铁蛋白nifH 基因为分子靶标[23-24],采用Illumina MiSeq技术分析不同林分类型下土壤固氮菌的群落特征,探讨该地区固氮菌群落的多样性和结构组成及与其土壤特性的关系,为了解土壤氮循环提供基础数据,同时为发挥暖温带森林土壤潜力和森林植被恢复重建等提供科学依据。
-
依据研究区内油松林、针阔混交林、蒙古栎林和核桃楸林4种典型林分类型分布情况,在每种林型下设面积为20 m × 20 m 3块标准地,共12块。分别对所选样地进行相关因子调查,样地基本概况见表1。样地中土壤类型均为山地棕壤,石砾较少,多为壤土、碎屑类结构,成土母质均为坡积母质,林龄均为成熟林,林分起源均为天然林。
林分类型
Stand types海拔
Elevation/m坡度
Slope/°坡向
Aspect凋落物厚度
Litter depth/ cm郁闭度
Canopy/%伴生树种
Associated tree species油松林
Pinus tabuliformis forest941 18 东 East 7 80 暴马丁香 Syringa amurensis
毛榛 Corylus mandshurica针阔混交林 Pine-poplar mixed forest 895 27 东南 Southeast 5 85 油松 Pinus tabuliformis
蒙古栎 Quercus mongolica
大花溲疏 Deutzia grandiflora
胡枝子 Lespedeza bicolor
元宝槭 Acer truncatum蒙古栎林
Quercus mongolica forest856 23 东北 Northeast 3.5 80 三裂绣线菊 Spiraea trilobata
平榛 Corylus heterophylla核桃楸林
Juglans mandshurica forest815 25 东 East 2.5 85 丁香 Syzygium aromaticum
白蜡 Fraxinus chinensis注:表中每个林分类型数据为3块标准地的平均值。下同。 Note:Data of each stand are mean of three sampling plots. The same below. Table 1. General characteristics of forest stands
-
于2019年7月进行野外调查和样品采集。在不同林型下随机设置3块20 m × 20 m 的标准样地,按五点法采集0~20 cm土样,去除土样内凋落物和石砾,混合均匀后用四分法取100 g左右的土,装入无菌自封袋中,共计12份土样放入便携式冰箱带回实验室。一部分放入−60 ℃冰箱保存,余下风干研磨用作土壤特性分析。
-
土壤特性采用常规分析方法:土壤pH 测定采用酸度计法;土壤全氮测定采用凯氏定氮法;土壤碱解氮测定采用碱解扩散法;土壤有效磷测定采用钼蓝比色法;土壤速效钾测定采用醋酸铵-火焰光度计法;土壤有机质测定采用重铬酸钾-外加热法[25]。
-
使用Omega Mag-bind soil DNA kit提取土壤微生物总DNA,合格后样品保存于−80 ℃冰箱用于PCR扩增。扩增引物选择nifH-F(5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′)和nifH-R(5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′)[26],对fungene-nifH区域进行扩增。每个样品重复扩增3次,扩增后的序列委托上海派森诺生物有限公司进行测定。PCR 反应体系:5 × 缓冲液5 μL;dNTP(2.5 mM)2 μL;正向引物(10 uM)1 μL;反向引物(10 uM)1 μL;DNA模板1 μL;超纯水14.75 μL;快速pfu DNA 聚合酶0.25 μL。PCR 扩增条件:98 ℃ 预变性5 min;98 ℃ 变性30 s,63.7 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸 45 s,共35个循环;72 ℃ 延伸 5 min。PCR 反应后,取5 μL产物进行1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测。
-
根据序列质量初步筛选出高通量测序的原始离线数据,并把数据上传至NCBI平台,序号为:SUB10898702。QIIME2 DADA2分析进行OTU聚类。采用CD-HIT方法,根据97% 的相似性对OTU进行分类,以获得每个OTU对应的物种分类信息,利用QIIME分析微生物α和β多样性,在门和属分类水平上比较不同林型土壤固氮菌群落结构组成差异。试验数据处理采用Excel、SPSS24.0和R完成。采用单因素方差分析(one-way ANOVA),Duncan 法比较不同林型的土壤特性、固氮菌多样性的差异(p < 0.05)。采用 Pearson相关系数评价固氮菌多样性与土壤特性之间的相关关系。采用冗余分析(RDA)检验固氮菌结构组成与土壤特性的关系。采用 Spearman 相关性检验,分析优势固氮菌和土壤特性的相关性,运用关联热图展现微生物群落组成与土壤特性的关系。
-
不同林分类型的土壤特性见表2。方差分析和多重比较表明,土壤有机质、全氮及速效钾在4种林型之间均有显著差异,碱解氮含量表现为:针阔混交林 > 油松林 > 核桃楸林 > 蒙古栎林,有效磷含量表现为:核桃楸林 > 蒙古栎林 > 针阔混交林 > 油松林。
林分类型
Stand typespH 有机质
SOM/(g·kg−1)全氮
TN/(g·kg−1)碱解氮
AN/(mg·kg−1)有效磷
AP/(mg·kg−1)速效钾
AK/(mg·kg−1)Pt 6.3 ± 0.26 ab 70 ± 2.6 d 1.6 ± 0.070 d 247 ± 10 b 2.8 ± 0.11 a 378 ± 15 d Mix 6.9 ± 0.35 c 59 ± 2.9 c 1.3 ± 0.060 c 315 ± 17 c 2.8 ± 0.14 a 95 ± 4.7 a Qm 5.9 ± 0.24 a 33 ± 1.4 a 0.88 ± 0.030 a 68 ± 2.8 a 3.8 ± 0.16 b 174 ± 7.1 c Jm 6.5 ± 0.27 bc 42 ± 1.7 b 1.1 ± 0.040 b 77 ± 3.1a 14 ± 0.58 c 142 ± 5.8 b 注:Pt 油松林(Pinus tabuliformis Carriere forest);Mix针阔混交林(Pine-poplar mixed forest);Qm 蒙古栎林(Quercus mongolica Fisch forest);Jm 核桃楸林(Juglans mandshurica Maxim forest)。表中数据为平均值±标准偏差;不同小写字母表示不同林分土壤特性指标在0.05水平上存在显著差异。下同(表3)。 Note: Pt, Pinus tabuliformis forest; Mix, Pine-poplar mixed forest;Qm, Quercus mongolica forest; Jm, Juglans mandshurica forest. The data in the table is the mean ± standard deviation; Different lowercase letters indicate that the properties indexes of soil samples of different forest stands are significantly different at 0.05 level. The same below (Table 3). Table 2. Soil properties of forest stands
-
不同林分类型下土壤固氮菌α多样性指数的统计结果见表3,Chao1指数由高到低表现为:油松林 > 针阔混交林 > 核桃楸林 > 蒙古栎林,核桃楸林和蒙古栎林之间差异不显著(p<0.05)。Shannon指数由高到低表现为:油松林 > 针阔混交林 > 核桃楸林 > 蒙古栎林,针阔混交林和核桃楸林之间差异不显著(p<0.05)。
林分类型
Stand typesChao1指数
Chao1 indexShannon指数
Shannon indexPt 486.28 ± 30.95 c 4.60 ± 0.23 c Mix 398.21 ± 16.14 b 3.63 ± 0.15 b Qm 264.29 ± 24.08 a 2.68 ± 0.38 a Jm 266.48 ± 12.22 a 3.44 ± 0.25 b Table 3. Alpha diversity index of soil nitrogen-fixing bacteria of forest stands
-
为进一步明晰样本间在群落物种组成上的差异性,基于Bray-Curtis距离算法并采用 PCoA 分析衡量4种林型土壤固氮菌群落物种组成的相似度。图1表明,每种林型的3 个重复均聚类于同一象限,且每种林分集合间距较大,PCo1 和 PCo2分别解释变量方差的41.7%、21.5%,两者累计贡献率达63.2%。表明4种林分类型下土壤固氮菌群落组间差异远大于组内差异。
-
为解析不同林型下土壤固氮菌群落结构的变异规律,对聚类后的 OTU 代表序列进行物种注释。4种林型土壤样品中的 OTU 隶属于 4 门 6 纲 13 目 16 科 29 属。将相对丰度低于 1% 以及在该水平上没有注释结果的归于 Others。4种林型土壤固氮菌在门和属水平上的群落组成见图2。
Figure 2. The soil nitrogen-fixing bacteria community compositions of different forest stands on phylum (a) and genus(b) level
在门分类水平上(图2A),4种林型土壤固氮菌均以变形菌门 (Proteobacteria)为主,其相对丰度范围是91.87%~73.89%。变形菌门的组成比例在针阔混交林土壤中最高(91.87%),在蒙古栎林中比例最低(73.89%)。同时在4种林型中还含有酸杆菌门(Acidobacteria),其相对丰度范围是7.91%~0.40%。另外, 厚壁菌门(Firmicutes)仅存在于油松林和针阔混交林土壤中,含量分别为4.97% 和1.76%。虽然群落组成相似,但是各菌门含量差异显著。
在属水平上,取所有样本中平均相对丰度前 10 位的菌群,结果表明4种林型下共有菌属为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium),相对丰度为39.24%~16.36%、广泛固氮氢自养单胞菌属(Azohydromonas),相对丰度为38.48%~5.98%、斯克尔曼氏菌属(Skermanella),相对丰度为28.24%~4.41%、弗兰克氏菌属(Frankia),相对丰度为7.91%~0.40%、中生根瘤菌属(Mesorhizobium),相对丰度为9.69%~0.34%、固氮螺菌属(Azospirillum),相对丰度为4.64%~0.17%。地杆菌属(Geobacter)仅存在于油松林和针阔混交林下土壤中,海细菌属(Marinobacterium)仅存在于油松林下土壤中,伯克霍尔德菌属(Burkholderia)仅存在于核桃楸林下土壤中。
按照97%序列相似性划分 OTU,根据 Bray-curtis 指数计算距离,得到相似性矩阵,进行群落结构差异分析。由 Venn 图可见(图3),4 种林型下共有 OTUs 数目为53个。其中,油松林与针阔混交林共有OTUs数目为124个,针阔混交林与蒙古栎林、核桃楸林共有OTUs数目78个,同为阔叶林的蒙古栎林与核桃楸林共有OTUs数目为181个。油松林土壤中所含特有OTUs数量最多为448个,核桃楸林土壤中特有OTUs最少为71个。
-
土壤特性与固氮菌的α 和 β 多样性的相关性分析如表4 所示。固氮菌α多样性与土壤有机质、全氮和速效钾呈极显著正相关,碱解氮与Chao1指数呈极显著正相关,与Shannon指数呈显著正相关,土壤有效磷与Chao1指数呈显著负相关。β 多样性数值为相应两个样本之间距离(距离矩阵的类型依据算法参数选择而定)。固氮菌的 β 多样性与土壤有机质和全氮呈极显著负相关,这与α多样性相反,而β 多样性与土壤速效钾呈及显著正相关。
土壤特性
Soil propertiesChao1指数
Chao1 indexShannon指数
Shannon indexβ 多样性
β-diversitypH −0.385 0.21 0.158 SOM 0.917** 0.833** −0.718** TN 0.903** 0.923** −0.793** AN 0.779** 0.596* −0.376 AP −0.582* −0.18 0.397 AK 0.672** 0.672** 0.886** 注:*p < 0.05 , **p < 0.01。
Note:*p < 0.05 , **p < 0.01.Table 4. Correlation coefficients between soil properties and α, β diversity of soil nitrogen-fixing bacteria community
-
采用冗余分析(Redundancy analysis, RDA)探究影响4种不同林型下土壤固氮菌群落组成的环境因子(图4)。主成分1(48.85%)和主成分2(16.63%)累计解释土壤固氮菌群落结构变异的65.43%。土壤全氮和有机质是影响土壤固氮菌群落组成的主要土壤特性因子。
Figure 4. Redundancy analysis(RDA)between soil properties and soil nitrogen-fixing bacteria community of different forest stands based on Bray-Curtis
采用Spearman相关性系数分析4种林型土壤特性与土壤固氮菌群落组成的相关性,丰度前20菌属的相关性热图(图5)。其中与土壤速效钾含量呈显著相关的菌属有9个,全氮8个,有机质5个,碱解氮3个,pH 2个。
Characteristics of Soil Nitrogen-Fixing Bacteria Community of Typical Forest Stands at Haituo Mountain, Beijing
- Received Date: 2021-10-09
- Accepted Date: 2022-01-27
- Available Online: 2022-08-20
Abstract: