Selection and Validation of Reference Genes for Leaf Color Phenotype in 'Maiyuanjinqiu', a Catalpa fargesii Variety, by qRT-PCR

试验材料取自河南省洛阳市扁担赵基地。样品采集后，立即用刀片将‘麦缘锦楸’叶片黄绿部分切分，分别命名为Y1（黄色）、Y2（绿色），灰楸叶片对应部位分别命名为G1、G2（图1）。切好的叶片用锡箔纸包裹后立即置于液氮中速冻，并转至−80℃保存。所有的样品均设置3次生物学重复。

Figure 1.  Samples of leaves of 'Maiyuanjinqiu' and C. fargesii.^[15]

RNA提取按照EASY spin植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）的操作说明进行。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的完整性，并利用超微量紫外分光光度计探头（Nanodrop 2000）检测所提取RNA的浓度与纯度。利用PrimeScript^™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（Takara，RR047A），将RNA样品反转录为cDNA，获得的cDNA样品置于−20℃保存备用。

以课题组前期未发表的‘麦缘锦楸’和灰楸转录组数据为依据，选取FPKM值大于100且在样品间无显著差异表达的6个基因（CfUBC、CfActin、CfPP2A、CfMADH、CfGADPH、CfEF-1）为候选基因，加上课题组前期常用的CbuActin^[17]共7个内参基因。

根据引物设计原则，利用在线工具Primer 3 Plus设计内参基因及CfGES基因引物，引物大小为18～27 bp，Tm值在58～61℃，扩增长度为150～250 bp，GC含量为40%～60%，并在NCBI上对引物进行特异性检测。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表1。以各候选基因引物做普通PCR扩增，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

将cDNA模板混合稀释8倍后，按照Takara公司的TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) 试剂盒（Takara，RR420A）说明书进行实时荧光定量PCR实验。反应体系为20 μL：TB Green Premix Ex Taq 10 μL，上游引物（10 μmol·L⁻¹）0.8 μL，下游引物（10 μmol·L⁻¹）0.8 μL，DNA模板1 μL，dd H₂O 7.4 μL。每个样品设置3个重复，所有操作均在冰上进行。利用LightCycler480实时荧光定量PCR仪对各样品进行扩增，PCR扩增程序为：95℃预变性30 s；定量分析40个循环：95℃ 变性5 s，60℃退火30 s；融解曲线：95℃ 5 s，60℃ 1 min后缓慢上升至95℃；降温：50℃ 30 s。

将各样品得到的Ct值按公式Q = E^{(minCt-sampleCt)}（E为扩增效率，默认值为2；minCt为基因在样品中的最小Ct值；sampleCt为基因在样品中的Ct值）进行计算，将得到的Q值导入GeNorm和NormFinder软件中进行稳定性分析。将各样品得到的Ct值输入到BestKeeper软件中，得到候选内参基因的表达稳定性（M值）、稳定值（SV值）、变异系数（CV值）和标准差（SD值），进行表达稳定性分析。使用3款软件分析后，将各样品得到的Ct值输入到在线网站RefFinder（https://www.heartcure.com.au/for-researchers/）中进行综合分析，得出最适合‘麦缘锦楸’不同叶色部位稳定表达的内参基因。

分别以综合分析排名最靠前的2个基因为内参，对萜类合成基因CfGES的表达情况进行分析，qRT-PCR方法参照1.2.4，结合CfGES基因的转录组数据，对2个内参基因进行表达稳定性验证。

Nanodrop检测到所有样品总RNA的OD_260/280及OD_260/230值均在1.8～2.2之间，说明所提RNA纯度较好，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品完整性（图2），各样品的28S和18S条带明显，说明总RNA完整性较好，均可用于后续试验。

Figure 2.  Total RNA electrophoresis of different leaf color parts of 'Maiyuanjinqiu' and C.fargesii.

图3显示：所有引物均能扩增出单一且亮的条带，无引物二聚体，条带大小与预期相符，引物特异性完好，可用于后续检测分析。对7个候选内参基因在各个样品的qRT-PCR分析表明：各基因Ct值均在23～35，且溶解曲线都呈现显著单一的峰（图4），表明qRT-PCR所用引物可与模板cDNA特异性结合并扩增靶基因。

Figure 3.  PCR products of seven reference genes.

Figure 4.  Real-time PCR melting curves of seven reference genes

7个候选内参基因中，CfActin的平均Ct值最大，为26.459，说明该基因的表达丰度最低；CfGADPH的平均Ct值最小，为20.91，说明该基因的表达丰度最高。7个内参基因的表达丰度大小排序依次是：CfGADPH > CbuActin > CfEF-1 > CfMADH> CfPP2A > CfUBC > CfActin（图5）。

Figure 5.  Average Ct values of seven reference genes

GeNorm是通过比较计算内参基因稳定性的M值，以确定表达最稳定的内参基因。该软件以M=1.5作为临界点，低于该值表明基因的表达相对稳定，且M值越小表示内参基因的表达越稳定^[18]。GeNorm分析结果表明：7个候选内参基因的M值均小于1.5（表2），即各候选内参的表达都相对稳定，稳定性排名从高到低依次是：CfMADH > CfEF-1 > CfGADPH > CfPP2A > CfActin11 > CfUBC > CbuActin。为确定内参基因的最佳数量，进一步通过配对变异系数Vn / (n + 1)，得出以4个候选基因同时做为内参基因的效果最佳，2个组合使用次之（图6）。

Figure 6.  The number of the most suitable reference genes analyzed by GeNorm software

NormFinder的计算原理与GeNorm相似，该软件是基于Excel结合组间方差与组内方差计算SV值，来确定内参基因的稳定性。SV值的大小与基因的稳定性呈负相关。NormFinder分析结果（表3）显示：CfUBC、CbuActin、CfActin11、CfPP2A、CfGADPH、CfEF-1、CfMADH基因在叶片不同颜色部位的表达稳定值分别为0.406、0.520、0.329、0.340、0.068、0.095、0.062，其中，CfMADH、CfEF-1和CfGADPH的SV值最小，说明这3个基因的稳定性较强。

BestKeeper通过计算变异系数（CV）和标准偏差（SD）来反映内参基因的稳定性，CV和SD的值与基因的稳定性负相关，其中，SD值的默认阈值为1.0，低于该值即认为表达稳定^[19]。BestKeeper分析结果（表4）显示：在灰楸及‘麦缘锦楸’叶片中，7个基因的SD值均小于1.0，说明各基因的表达均较为稳定，并且稳定性从高到低排序依次是：CfActin11、CfMADH、CfGADPH、CfEF-1、CbuActin、CfPP2A、CfUBC，其中CfActin11的CV和SD值最小（CV=0.80；SD=0.21），表达最为稳定；CfUBC的CV和SD值最大（CV=2.35；SD=0.62），其表达最不稳定。

对GeNorm、NormFinder以及BestKeeper 3种软件的数据进行整合分析，综合评估基因的表达稳定性。将各基因在不同样品中的Ct值导入在线网站RefFinder（https://www.heartcure.com.au/for-researchers/）中。结果显示，各基因稳定性综合排名由高到低依次为CfMADH > CfEF-1 > CfGADPH > CfActin11 > CfPP2A > CfUBC > CbuActin (图7)，其中，CfMADH和CfEF-1的表达稳定性最好，符合qRT-PCR实验内参基因的选择标准。

Figure 7.  Stability ranking of seven genes by RefFinder analysis

分别以CfMADH和CfEF-1为内参，分析萜类合成酶基因CfGES在‘麦缘锦楸’和灰楸不同叶色部位（Y1、Y2、G1、G2）的表达量差异，以验证软件预测结果的可靠性。结果表明：单独或组合使用CfMADH及CfEF-1基因为内参时，CfGES基因的表达差异与转录组测序结果趋势一致（图8）。因此，本研究结果表明：单独使用CfMADH、CfEF-1基因或组合使用这2个基因，能够准确校准‘麦缘锦楸’不同叶色部位的荧光定量结果。

Figure 8.  The expression differences of CfGES among different leaf color sectors of 'Maiyuanjinqiu' and C. fargesii .

基因表达分析是分子生物学科中最为重要的研究内容之一，qRT-PCR是当前最常用的检测基因表达情况的技术手段，常用来检测基因在不同样品、组织、生长发育时期及特定实验条件下的表达模式^[20]。对基因进行表达情况分析时，必须选择准确的内参基因做标准化分析^[21-22]。众多研究中发现，管家基因可作为内参基因来进行表达量分析。然而近年来有研究发现，内参基因并不具有通用性，需要根据特定的物种或实验条件来确定最适宜的内参基因^[23-24]。如GADPH在黄山栾树、银杏、肉桂和大叶清化桂中稳定表达^[25-27]，但在丝瓜和苎麻中却被认为是最不理想的内参基因^[28-29]。18SrRNA基因在红豆杉多种处理下都表现出较好的稳定性^[30]，但在稻瘟病菌侵染的水稻、灵芝及红木不同处理下该基因的表达最不稳定^[31-32]。目前尚未发现能在各类实验条件下都稳定表达的内参基因，所以研究者需要根据自己的实验条件找到可以作为标准化的基因进行定量分析。

GeNorm、NormFinder和BestKeeper是基因组研究中筛选稳定内参基因最常见的计算软件，本研究应用3款软件及1个分析网站对7个候选内参基因的稳定性分析发现，这7个内参基因在‘麦缘锦楸’和灰楸叶片中均稳定表达，但稳定性排名略有差异：在GeNorm和NormFinder中均得出CfMADH和CfEF-I是最稳定的内参基因，而在BestKeeper中CfMADH和CfEF-I的排名却分别居于第2和第4名，排名的差异可能是由于3款软件所设定的统计学算法不同所导致的。GeNorm和NormFinder的原理基本相似，都是将qRT-PCR所得到的Ct值转化为基因相对表达量，再进行最适内参的分析，每个候选基因的稳定性取决于单个样品的最小Ct值；而BestKeeper则直接在内置公式中输入各基因表达的Ct值来进行分析，候选基因的稳定性与每个样品Ct值的离散程度相关，因此，该算法易受极端值影响，无法规避系统误差^[33-34]。考虑到每款软件的局限性，笔者利用RefFinder对这3款软件得出的结果进行综合分析，确定了7个候选内参基因在‘麦缘锦楸’叶片中的稳定性排名依次是：CfMADH > CfEF-1 > CfGADPH > CfActin11 > CfPP2A > CfUBC > CbuActin。在GeNorm分析的内参基因变异系数配对值来看，n=4时，Vn / (n+1)的比值最小，是最佳的内参基因组合数量，n=2次之，但综合考虑实验成本及样品用量问题本文认为组合使用2个候选基因作为内参更为合适，此前也有研究认为以2个或2个以上基因为内参更能校准定量分析实验上的系统偏差^[35]。

萜类物质（叶绿素、胡萝卜素）在叶色形成过程中有重要的作用。在本课题组转录组数据中发现，萜类合成酶基因CfGES 在‘麦缘锦楸’和灰楸不同叶色部位中差异表达，可以验证候选内参基因的稳定性。CbuActin是课题组前期利用同源克隆法获得的内参基因^[17]，在‘麦缘锦楸’和灰楸叶片中其M<1.5（M=0.790），符合作为内参基因的标准，但本研究通过软件分析排名最好的内参基因是CfMADH和CfEF-1。笔者分别以这2个最适合的内参基因及其组合来校准CfGES的表达量，结果表明单独或组合使用CfMADH和CfEF-1时，CfGES的表达差异与转录组数据一致，进一步表明了本实验结果的可靠性。本研究所筛选到的最适内参基因CfMADH和CfEF-1均为真核生物中常见的管家基因，在其他观赏性树种（紫薇、花叶唐竹等）的不同叶色叶片中也被报道可作为理想内参基因^[36-38]。此外，本研究材料中CfUBC和CfActin11在‘麦缘锦楸’叶片中稳定性不佳，但在其他物种（如景宁木兰、板栗）中却表现出很好的稳定性^[39-40]，这些结论也体现了内参基因不具有通用性的特点。

本研究根据课题组前期研究及转录组数据筛选出7个候选基因（CfUBC、CfActin11、CfPP2A、CfMADH、CfGADPH、CfEF-1及CbuActin），结合qRT-PCR技术及GeNorm、NormFinder和BestKeeper等内参分析软件对各候选基因进行稳定性分析，结果表明CfMADH和CfEF-1是最适合‘麦缘锦楸’和灰楸不同叶色部位的内参基因，萜类合成基因CfGES验证了软件分析结果的可靠性。本研究优化了紫葳科植物‘麦缘锦楸’内参基因的选择，将为‘麦缘锦楸’叶色形成的分子生物学机制提供理论基础，也将为课题组及其它植物研究选择合适内参基因提供参考依据。