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竹卵圆蝽(Hippotiscus dorsalis (Stål))是广泛分布于我国各竹产区的一种重要害虫。竹卵圆蝽的若虫和成虫在竹秆和竹枝的节上吸食汁液,致使被害枝条落叶枯死,严重者可致整株竹子死亡[1-2]。据2015年统计,浙江省安吉县毛竹林竹卵圆蝽的有虫株率在56.78%以上,单株最高虫口达到254头,且近几年来其危害呈上升的趋势[3]。因此,竹卵圆蝽仍是我国部分竹产区高危险性的害虫。
依据竹卵圆蝽群聚吸汁和越冬若虫上竹危害的生物学特性,我国学者提出了人工捕捉、粘虫胶带粘虫、竹腔注射化学农药、喷撒化学农药等防治方法[4]。这些方法在短期内取得较好的防治效果,但也存在很多不足。竹卵圆蝽的臭腺能分泌防御性化学物质,这些化学物质可引起人的皮肤发黄、起泡、溃疡等症状,故人工捕捉竹卵圆蝽时常常会伤及作业人员。化学农药的不合理使用,易产生害虫抗药性增强、次要害虫爆发、环境污染、人畜中毒、林产品品质下降等风险[5-8]。
生物防治具有靶标性强、对人畜安全、环境兼容性好等优点,是害虫绿色防控的重要措施。通过对竹卵圆蝽天敌昆虫的调查,已经找到数种寄生性和捕食性的天敌昆虫[2, 9-10],但这些天敌昆虫在自然界中的数量有限,人工繁育技术不成熟,难以在生产中大规模应用。昆虫病原真菌因其易于室内大规模繁育、储存和运输,施用技术简单,而成为最具开发潜力和应用前景的生物防治制剂之一[7, 11]。本研究通过组织分离法,从罹病的竹卵圆蝽体内分离病原真菌,通过形态学、DNA条形码相结合的方法对病原真菌进行物种鉴定,采用生物测定法评价不同菌株的毒力,筛选出对竹卵圆蝽若虫具有高毒力的菌株,研究结果为竹卵圆蝽的生物防治提供科学依据。
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本研究使用16头竹卵圆蝽僵虫进行分离培养,共得到7株昆虫病原真菌,7株昆虫病原真菌的编号分别为LYC4、LYC5、LYC6、LYC8、LYC10、LYC11和LYC15。观察分离菌株在PDA固体培养基上的培养性状,该病原真菌在培养基的接种点处长出菌落,菌落包围接种的僵虫,初期菌落为白色绒毛状,后期菌落呈淡黄色粉状。将菌落置于显微镜下观察,其菌丝体白色,分生孢子球形,直径2.93±0.35 μm(图1B),分生孢子常数百个聚集成致密的球状体,球状体白色,直径34.13±5.06 μm(图1A)。依据该菌的形态特征和在PDA固体培养基上的培养性状,参考Zimmermann对球孢白僵菌(Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin)的描述[12],初步鉴定为球孢白僵菌。
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采用引物对ITS1/ITS4进行PCR扩增, 7个样品都能够扩增出约600 bp的特异性条带(图2),条带的大小与预期一致。PCR扩增的产物测序和序列分析,得到7个菌株530 bp的ITS rDNA序列。多序列比对表明,7个菌株ITS rDNA序列仅有1个核苷酸位点的差异,同源性为99.97%。ITS rDNA序列提交到DNA条形码鉴定数据库BOLD,进行DNA条形码鉴定,所有7株昆虫病原真菌均鉴定为球孢白僵菌。ITS rDNA序列同时提交到NCBI数据库在线比对,结果表明,LYC4、LYC6、LYC8、LYC10、LYC11、LYC15和LYC5菌株与NCBI数据库中球孢白僵菌(GenBank登录号:MN122432、MK229193、MG345086、MK490863、MH367274、MN401662)ITS rDNA序列的同源性为100.00%。
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本研究使用4株球孢白僵菌的2种不同浓度的分生孢子悬浮液进行室内毒力测定。研究表明:被球孢白僵菌侵染的竹卵圆蝽若虫的活动性降低,取食减少,并逐渐死亡。虫体死亡后,首先在足部以及躯干的体节处长出白色的菌丝,后期整个虫体被球孢白僵菌包裹。通过连续13 d观察和记录累计死亡率,所有4个菌株对竹卵圆蝽若虫都具有很高的致病性。从校正累计死亡率曲线图上看出:最初的1~4 d,4个菌株对竹卵圆蝽若虫的致病力均较低,从第5天开始校正累计死亡率迅速上升,LYC11菌株在第11 天时,校正累计死亡率达到100.00%,而LYC10和LYC15菌株均在第12 天时,校正累计死亡率达到100.00%(图3)。研究还发现,LYC10、LYC11和LYC15菌株的分生孢子浓度为108孢子·mL−1时,其校正累计死亡率高于分生孢子浓度为107孢子·mL−1的值。
采用SPSS24.0进行线性回归分析,获取回归方程和决定系数,依据回归方程计算LT50。所有处理的决定系数R2都在0.800以上,死亡率和时间之间存在显著的线性关系(表1)。4个菌株对竹卵圆蝽若虫的致死中时间LT50在5.04~14.03之间。当分生孢子浓度为108孢子·mL−1时,LYC10、LYC11、LYC15和LYC4菌株的致死中时间LT50分别为5.04 、5.45 、6.17 和14.03 d(表1)。
菌株
Strains浓度
Concentrations/
(分生孢子conidia·mL−1)回归方程
Regression
equation决定系数R2
Correlation
coefficient R2LT50/d 累计死亡率
Cumulative mortality/%校正累计死亡率
Corrected cumulative
mortality/%LYC4 1 × 107 y=3.255x + 1.967 0.954 8.55 91.667 81.251 1 × 108 y=2.06x + 2.637 0.802 14.03 83.333 62.499 LYC10 1 × 107 y=8.611x−2.221 0.927 6.90 94.444 87.499 1 × 108 y=3.351x + 2.647 0.892 5.04 100.000 100.000 LYC11 1 × 107 y=4.38x + 0.869 0.942 8.77 91.667 81.251 1 × 108 y=4.295x + 1.838 0.878 5.45 100.000 100.000 LYC15 1 × 107 y=5.338x + 0.145 0.937 8.12 91.667 81.251 1 × 108 y=3.756x + 2.032 0.925 6.17 100.000 100.000 Table 1. Pathogenicity and LT50 of the tested B. bassiana strains against H. dorsalis larvae
校正累计死亡率越高,毒力越强;致死中时间LT50越小,毒力越强。综合以上研究结果,确定4株菌株对竹卵圆蝽若虫的毒力从高到低依次为:LYC10>LYC11>LYC15>LYC4。
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林间生物测定表明:LYC11菌株对竹卵圆蝽若虫具有很高的防治效果,随着分生孢子浓度升高,累计死亡率快速升高。在接菌后第18天,5×107、1×107、1×106、1×105、1×104孢子·mL−1 5个浓度的分生孢子的累计死亡率分别为79.80%、78.89%、77.99%、54.12%、57.14%。
Probit回归分析表明:LYC11菌株的累计死亡率与分生孢子浓度之间的回归方程为y=0.234x−1.025;Pearson拟合优度检验结果为χ2=3.745,P=0.290>0.050,差异不显著,模型拟合良好。依据置信限度表得出LYC11菌株对竹卵圆蝽若虫的致死中浓度LC50为2.43 × 104孢子·mL−1。
Isolation and Virulence of Beauveria bassiana Against Hippotiscus dorsalis
- Received Date: 2021-08-24
- Accepted Date: 2021-11-15
- Available Online: 2022-04-20
Abstract: