The Relationship between Floral Initiation and Spring-shoot Growth in Camellia oleifera

试验地位于江西省新余市分宜县中国林业科学研究院亚热带林业实验中心（27°49′26″ N，114°39′46″ E），属亚热带季风性湿润气候，低山丘陵地貌，坡度5°，海拔87.96～92.26 m，土壤为酸性红壤，属于我国油茶的主要产区。试验林为2009年采用2年生芽苗砧无性系嫁接苗造林的成林，树龄12 a，株行距4 m × 3 m。

在长林53号油茶试验品种内选取长势、冠幅一致的单株9株，每3株作为1个生物学重复，共计3个生物学重复。选取生长于枝条顶端往下的第2个叶片的叶芽进行标记，每株标记10个芽。自2019年2月12日起，每隔7 d拍照观察生长状态。

选取试验植株东南西北4个方向的中上部各1个枝条，做好标记，共选取30个枝条，2019年4月2日开始测量春梢的长度和粗度；同时，在每株东南西北4个方向的中上部各采集2根新稍，分别收集新叶、新茎，放于锡箔纸袋中，置于液氮中速冻，带回实验室后置于−80 ℃超低温冰箱保存备用。每7 d进行1次测量、采样。

将采集的样品置于液氮中研磨至粉末状。称取40 mg研磨后的样品，置于15 mL离心管中，加入250 μL纯丙酮，5 min后加入8 750 μL 80%的丙酮溶液，震荡摇匀，于黑暗中静置12 h，待样品完全变白后，再加入1 mL 80%的丙酮溶液，震荡摇匀，黑暗中静置2 h，离心（5 000 g，20 ℃，5 min），吸取上清液。采用紫外分光光度计，在470、646、663 nm 处测量溶液吸光值。叶绿素含量计算公式如下：

叶绿素A（Chla）浓度（mg·L⁻¹）= A₆₆₃ × 12.21−A₆₄₆ × 2.81；

叶绿素B（Chlb）浓度（mg·L⁻¹）= A₆₄₆ × 20.13−A₆₆₃ × 5.03；

类胡萝卜素（Car）浓度（mg·L⁻¹）= (A₄₇₀ × 1 000−Chla × 3.27−Chlb × 104)/229；

叶绿素含量（mg·g⁻¹）=叶绿素浓度 × V/W。

式中：A₆₆₃表示663 nm处吸光值；A₆₄₆表示646 nm处吸光值；A₄₇₀表示470 nm处吸光值；V表示样品体积（L）；W表示样品质量（g）。

与2.2节采样时间一致，选取每株东南西北4个方向的中上部各5个枝条，采集每根枝条的顶芽和前2个侧芽，一部分置于FAA固定液中保存，一部分置于Motic SMZ-171体视显微镜下解剖拍照后置于固定液中保存备用。将固定于FAA中的花芽取出，用PBS缓冲液清洗2次，经70%（1次）、85%（1次）、95%（2次）、100%（2次）的乙醇脱水，采用CO₂临界点干燥仪（日立HCP-2）临界点干燥6 h后，使用离子溅射镀膜仪（日立E1010）喷金，样品处理完后置于干燥箱中备用。采用S-4800超高分辨率扫描电子显微镜观察，拍照。

采用office 2019、Statgraphics、Photoshop 等软件进行数据分析和图片处理。

油茶春梢由上一年形成的叶芽发育生长而成，油茶花芽发生于当年生春梢的顶端和叶腋，春梢的生长与花芽的分化、发育密切相关。本研究自2019年2月12日开始调查并拍照记录长林53号油茶叶芽生长状态，图1表明：2月12日至3月12日，叶芽呈休眠状态，3月19日叶芽开始明显的伸长，苞片紧密包裹住叶芽顶端，顶端呈锥形；3月26日，叶芽分化出的第1片叶片呈卷曲状突破顶端的萼片，自此叶芽分化成春梢，进入春梢的生长阶段。

Figure 1.  Investigation on new shoot growth of Camellia oleifera

长林53号油茶春梢生长过程中，萼片在4月23日完全退化，叶片数量在4月16日全部分化形成，叶片颜色变化为黄绿色-绿色-墨绿色，茎颜色变化为褐色-绿色-褐色。本研究自4月2日开始调查油茶春梢生长规律（图2）。4月2日，春梢形成，可见3片叶片，仅1片叶片展开，其它叶片成合抱状生长于枝条顶端，叶片黄绿色，4片白色的萼片生长于春梢中下部，新茎呈深褐色，密布白色的绒毛。4月9日，春梢进一步增粗增长，形成7片叶片，叶片黄绿色，萼片开始退化，2片萼片生长于春梢下部，新茎呈浅褐色，密布白色的绒毛。4月16日，春梢进一步增粗增长，形成8片叶片，下部叶片呈浅绿色，上部叶片呈黄绿色，萼片进一步退化，1片萼片生长于春梢下部，新茎呈绿色，密布白色的绒毛。4月23日，春梢进一步增粗增长，叶片数量没有变化，叶片颜色均为浅绿色，萼片完全退化，新茎呈绿色，少量绒毛。4月30日春梢和新茎均呈绿色。5月7日至14日叶片呈深绿色，新茎底部呈褐色。5月21日叶片颜色进一步加深，新茎全部呈褐色。5月28日叶片颜色进一步加深，6月4日叶片呈墨绿色，新茎颜色无明显变化。

Figure 2.  Investigation on new shoots growth of Camellia oleifera

长林53号油茶春梢生长分为三个阶段：快速生长阶段（4月2日至16日）、平缓生长阶段（4月23日至5月21日）、生长完成（5月28日以后）。结合形态学特征（图2）和图3可以看出：4月2日至16日为春梢长度和粗度的快速生长阶段，该阶段萼片退化，完成叶片的分化，茎快速的伸长和增粗、颜色由褐色变为绿色；4月23日至5月21日为油茶春梢的平缓生长阶段，该阶段叶片数量不再产生变化，叶片颜色由黄绿色转变为绿色，茎由绿色变为褐色；5月21日以后春梢基本停止了伸长和增粗生长，但此后叶片颜色会进一步加深，在6月4日叶片颜色变成墨绿色。

Figure 3.  Length and diameter of new shoots during growth

油茶春梢生长过程中新叶和新茎的颜色是春梢生长发育的重要指标，从图4a看出：叶绿素A是新叶中主要的叶绿素成分，4月2日至9日是新叶中叶绿素A的快速增长期，4月16日至5月14日为稳定期，5月21日至6月4日叶绿素A开始了第2次增长，这与图2中叶片颜色变化的规律一致；叶绿素B的快速增长期在4月2日至9日，4月16日至5月7日呈降低趋势，随后趋于平稳，5月28日后稍微增加；类胡萝卜素在4月2日至9日快速增长后趋于平稳，5月28日后稍微增加。由此可知，在春梢的生长发育过程中，叶片中叶绿素A呈快速增长-平稳-增长的变化模式，叶绿素B呈快速增长-降低-增长的模式，类胡萝卜素呈增长-平稳-增长的模式。从图4b看出：油茶春梢生长发育过程中，新茎中叶绿素A、类胡萝卜素在经过短暂的升高之后呈降低趋势；叶绿素B呈降低趋势,在5月21日之后，未检测到叶绿素B。由图2～4可以看出：油茶春梢生长过程中新叶、新茎中叶绿素A含量变化与春梢的生长变化表现出相似的规律，说明新叶、新茎中叶绿素A含量可以作为评价油茶春梢生长的一项指标。

Figure 4.  Chlorophyll concentration of new leaves (a) and stems (b) during the new shoots growth

油茶花发育与春梢的生长同时进行，花发生于混合芽的第一轮苞片内侧（图5）。对油茶春梢生长过程中的花芽进行解剖，在春梢刚刚形成时（4月2日），外侧无法看见花芽（图5a），剥去外侧第1片苞片，发现花芽原基已经形成，生长于剥开第一轮苞片的混合芽上（图5b）或者第一轮苞片内侧（图5c），第1片萼片已经开始分化。为进一步确认花芽的发生部位， 4月16日后再次剥去混合芽（图5d）的外侧第1片萼片，可见已经完成形态分化的第1片萼片（图5e），去除花芽的萼片可以看到内侧花芽的萼片正在分化（图5f）。5月14日可见混合芽外侧第1片萼片明显向外凸起（图5g），剥去第1片萼片后可见混合芽的两侧形成了2个花芽，中间为叶芽（图5h），花芽和叶芽萼片均为绿色。6月4日可见花芽突破混合芽外侧萼片生长出来（图5i），花芽萼片为红褐色，叶芽萼片为绿色。此外，可以看出混合芽分化的早期，叶芽的生长势优于花芽，但随着混合芽以及花芽的生长发育，花芽的生长势逐渐优于叶芽。

Figure 5.  The position of floral initiation

长林53号油茶花芽分化分为三个时期：萼片分化期、花瓣分化期、雌雄蕊分化期。在油茶花芽萼片分化期（图6a～c），首先芽原基形成并向上凸起（图6a），花芽原基的侧边形成萼片（图6b），在萼片分化的过程中萼片外侧开始出现绒毛（图6c），萼片分化完成后，花芽原基顶部呈半球形（图6d），花芽分化进入花瓣分化期（图6d～j），花芽原基先分化出1片花瓣（图6d），随后依次分化出第2、3、4、5、6、7片花瓣（图6e～j），在花瓣分化的过程中，花芽原基逐渐呈扁平状变大并向内凹陷。接着，进入雌雄蕊分化期（图6k～o），雄蕊原基早于雌蕊原基向外凸起形成（图6k），在雄蕊原基分化出第1圈雄蕊的同时，雌蕊开始形成（图6l），然后雄蕊原基开始分化出第2、3、4圈雄蕊，雌蕊进行形态的分化（图6m～n）至形态分化完成（图6o～p）。

Figure 6.  Flower bud differentiation and floral organ development of Camellia oleifera

同时，笔者还研究了花芽分化过程中叶芽与花芽的区别。结果发现，花芽的萼片分化期也是叶芽的萼片分化期，此时花芽原基和叶芽原基形态上没有明显的区别（图7a），花芽分化进入花瓣分化期后，叶芽逐渐停止分化并进入休眠阶段（图7b），花芽原基继续分化出多个花瓣（图7c），这表明花瓣是花芽区别于叶芽的特异性器官。

Figure 7.  Morphology of flower bud primordia and leaf bud primordia

开花是高等植物的生长发育事件，不仅涉及到物种遗传信息的传递、种群的繁衍、种群数量的控制、物种的多样性，还涉及到农艺作物的产量与经济效益^[10-11]。植物开花由内部遗传因素和外部环境因素共同决定，在感知外界环境信号改变的同时协调自身的发育状态，选择最合适的时期开花，最大程度地保证物种的延续^[4]。对植物开花调控过程的描述并没有明确的统一标准，周琴等^[3]认为，高等植物的开花包括成花诱导、花发育和开花三个阶段；在《植物细胞分化与器官发生》中，作者认为植物开花的第一步是开花启动，开花启动包括成花诱导和成花信号转导，开花启动后进入花器官属性决定和发生阶段^[12]。在拟南芥、水稻等1年生草本植物中，营养生长向生殖生长转变标志着成花的开始，因此，成花转变通常被用来表示成花的起始。在芒果（Mangifera indica L.）、苹果（Malus domestica Mill.）、甜樱桃（Rubus idaeus (L.) Moench.）、麻风树（Jatropha curcas L.）等多年生木本植物中，成花的起始包括生命周期中的成花起始和年生长周期中的成花起始，通常用成花启动来表示年生长周期中成花的开始^[13-15]。在茶树研究中，笔者认为开花分为成花诱导、成花转变、花器官分化，茶树的花芽分化分为初分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌蕊和雄蕊形成期^[9]；在胡玉玲等^[16-17]对油茶花发育的研究中认为，植物成花包括成花诱导、信号转导、花芽原基形成、花器官分化5个阶段，并将前2个阶段划分为生理分化期，认为在该阶段植物茎尖分生组织形态上没有明显的变化，但是内部的基因表达和生理指标却发生了显著的变化。由以上研究可知，既然成花诱导和成花信号转导阶段都没有明显的形态学变化，那么如何从形态学上确认这一事件已经发生？在本研究中，作者将成花诱导、成花信号转导阶段统称为成花启动阶段，花芽原基形成作为成花启动的形态学标志。

油茶属于多年生常绿树种，秋冬开花，当年生春梢为主要的结果枝^[18-20]。春梢一般在3月下旬萌发，其生长受水肥条件、激素水平的影响，春梢的生长与花芽分化、果实产量高度相关^[21-25]。在春梢生长展叶的同时，春梢的顶部和叶腋形成顶芽和腋芽，顶芽和腋芽在4月份春梢停止生长时也基本停止生长，花芽分化在春梢基本结束生长后开始^[5]。油茶花芽分化通常分为前分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房与花药形成期、雌雄蕊成熟期6个时期，因品种的差异油茶花芽分化开始的时间从5月上旬至6月初不等^[6-7]，花芽分化时间也受水肥条件的影响^[26]。本研究发现，油茶在春梢生长与展叶的同时，花芽原基在顶芽或腋芽中形成并进入萼片分化阶段，油茶的顶芽和叶芽均为混合芽，花芽原基形成于混合芽基部。因此，认为在这一阶段之前油茶的成花诱导和信号转导就已经开始了，油茶花芽原基的形成与春梢的萌动同时发生。

本研究发现，油茶春梢生长的3个阶段（快速生长阶段、平缓生长阶段、生长完成）分别与萼片分化期、花瓣分化期、雌雄蕊分化期依次对应，而不是春梢生长基本完成后开始花芽分化。这与其它研究者关于花芽分化的研究结果不一致，但笔者发现春梢基本生长完成时，油茶进入花瓣分化初期，即花特异性器官出现。因此，本研究认为袁德义等^[8]、王湘南等^[9]研究中的前分化期、萼片形成期均为油茶的萼片形成期，且萼片形成期的起始时间还应向前推至春梢生长阶段。萼片分化阶段的花芽原基从形态上与叶芽原基没有明显的差异，花瓣的出现是油茶花芽分化中花芽区别于叶芽的特异性器官，本研究将其出现的时间确定为油茶完成成花启动的时间。既然在春梢生长的同时花芽原基形成，那么成花诱导和信号转导的时间必然早于这个时间，这也表明油茶的成花诱导和春梢萌动的诱导为同一诱导过程，同时也暗示着成年油茶春梢的萌动即启动成花。

成年油茶花芽原基形成于春梢顶芽或腋芽基部，春梢萌动即成花启动，春梢生长发育与花芽分化同时进行。花瓣是油茶花芽分化区别于叶芽分化的特异性器官，花瓣出现的时间为形态学上油茶完成成花启动的时间。油茶春梢生长的快速生长阶段、平缓生长阶段、生长完成阶段分别与萼片分化期、花瓣分化期、雌雄蕊分化期依次对应。