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菌根是建立于植物根系和土壤菌根真菌之间的古老共生体系,在自然界中存在已有4亿年之久[1],有研究统计,地球上大约86%的陆生被子植物能够与真菌互作形成菌根共生体[2-3]。丛枝菌根真菌(AMF)作为植物根系所在土壤环境中微生物群落的重要组成者之一,在个体层面可以促进植物对K+、Ca2+、Mg2+离子的有效吸收,帮助植物抵御逆境中来自生物或非生物的胁迫,宏观群落层面则能够优化植被分布,森林中地下的庞大菌根系统能够将林木个体有机相连而形成一个物质资源共享体,加速种群建成并形成植物优势种,从而改变生态格局[4-6],可以说,菌根真菌和植物共生,是维护森林生态系统稳定及发展的基础[7-8]。
高山栎(Quercus spp.)作为一类广泛分布在我国西部川、滇、藏地区的常绿硬叶栎类植物,是横断山脉地区重要的野生植被群落优势种,多以成规模的林地出现或以离散点状方式与其他乔木混生生长于海拔1 800~4 800 m的地区[9-10],其热值高、生长速度快及萌蘖更新能力强的特点对该地区生态环境保持具有重要意义[11-12]。当前,外界公认松科植物共生菌根类型为外生菌根已毋庸置疑,而栎属植物存在外生菌根共生现象的同时,是否能与内生菌根真菌共生尚鲜有报道。杨淑娇等[13]对云南香格里拉高山栎和高山松(Pinus densata Mast.)的林下菌塘微生物分布研究发现,高山栎林下菌塘有大量AMF存在,且高山栎林下菌塘中真菌和AMF生物量显著高于高山松,但AMF种类丰度只有1种,综合高山栎和高山松林型下菌塘的多种微生物比较认为,菌塘中的微生物类型是其菌落结构组成的重要影响因素,林型则未影响林下微生物群落特征构成。该研究说明在错综复杂的地下根系网络中,不同类型土壤微生物之间的相互联系往往对宿主植物林下菌群结构和分布具有重要影响。张中峰等[14]将摩西球囊霉(Glomus mosseae (Nicol. & Gerd.) Gerd. & Trapp)和根内球囊霉(Glomus intraradices Schenck & Smith )接种至青冈栎(Quercus glauca (Thunberg) Oersted)幼苗发现,AMF能够显著促进青冈栎幼苗叶面积和生物量增长,提升幼苗成活率,该结果表明,在人为干扰措施下,栎属植物能够与AMF形成互惠共生关系。基于上述前人研究不难推测,AMF与高山栎组植物间应当存在相应的联系。这种联系是否具有广泛性和普遍性?同为被子植物门下的栎属植物高山栎根系在非人为干扰的野生生境中,其根际及根系是否同AMF共生等问题值得深入探究。基于此,本研究假设横断山脉亚高山地区高山栎林下同样具有AMF分布,并且在自然条件下高山栎植物根系存在AMF。分三步验证上述假设:第一,利用湿筛沉淀法对采自横断山脉不同地区高山栎林下土壤样本进行孢子湿筛,利用形态学、分子生物学结合的手段对其种类进行鉴定。第二,利用分子克隆方法选取针对AMF 18S rRNA gene的特异引物对高山栎外根际潜在的AMF进行扩增,测序检验扩增结果中是否存在AMF。第三,利用染色观察的方法观察高山栎根系样本内是否存在典型的AMF丛枝、泡囊结构,结合对比单孢提取与克隆扩增结果,以期明确横断山脉亚高山带自然环境中生长的高山栎林下根围、根际AMF种类,揭示横断山脉亚高山高山栎林下AMF的演化方向。
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横断山脉作为世界年轻的山脉群之一,纵跨川、滇二省西部及西藏东部,山岭曲折蜿蜒,谷高差悬殊,植被分布以海拔梯度差异明显,受高空西风环流、印度洋及太平洋季风环流影响,气候主要分为干湿两季,降水多集中于5—10月,但因地形地势复杂,地域辽阔,年均气温13.6 ℃,年降水量942.6 mm,部分地区降雨差异较明显[9,15]。由于该地区地势陡峭,降雨所致的水土流失成为潜在威胁。
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于2020年7月、10月和2021年8月分别前往位于28°45′3″~30°59′35″ N, 97°40′25″~102°50′18″ E(四川、西藏等地)以及99°11′46″E、28°11′51″N(云南香格里拉)地段,横断山脉亚高山带的不同海拔(2 340~3 630 m)地区(表1)阳坡地段高山栎天然林,各高山栎林均为乔木或灌木纯林,林下无其他植被。采集其根部10~30 cm处的土壤混合装入9号自封袋,沿主根对高山栎根系进行挖掘,找到高山栎根系侧根、须根等与根际土装入自封袋,放入含冰袋的保温箱隔离贮存,标记并编号,带回实验室将根系于−80 ℃保存,土壤平铺风干置于塑封袋用于后续实验。
树种
species采集地
collected location经纬度
Altitude & Longitude海拔/m
Elevation树高/m
Tree height胸径/地径
DBH/cm坡度/(°)
Slope编号
Sample NO.高山栎
Quercus semicarpifolia西藏林芝察隅
国道219、559旁97°29′17″~
97°29′19″ E
28°50′7″~
28°50′27″ N2 610 28 92 33 GSL1 14 20 3 18 40 4 24 80 4 长穗高山栎
Quercus longispica西藏林芝察隅国道559旁 97°11′29″ E
29°13′31″ N3 440 2.0 6 阳坡12 GSL2 刺叶高山栎
Quercus spinosa四川阿坝马尔康县梦笔山 31°43′28″ E
102°16′38″ N3 630 2.2 4 半阳坡28 GSL3 川滇高山栎
Quercus aquifolioides四川阿坝巴郎山国道310旁 102°50′18″ E
30°59′35″ N3 480 2.1 4.5 阳坡30 GSL4 高山栎
Quercus semicarpifolia西藏察隅桑久村219国道 101°8′42″ E
31°52′42″ N2 970 1.8
3.28
18阳坡48 GSL5 乔木型高山栎(未鉴定)
Quercus arborescens
(not identified)云南香格里拉奔子栏镇附近 99°11′46″ E
28°11′51″ N2 740 17 55 阳坡30 G Table 1. Survey of the distribution of several types of Quercus sample plots in the subalpine regions of Transverse Mountains
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对高山栎根部10~30 cm土壤的筛取结果表明:各高山栎样地下均有大量AMF孢子存在,孢子直径为50~220 μm,形状以球形、近球形为主。颜色多以黑色和深棕色出现,偶见棕黄或深棕红,其中,部分孢子呈黑色,该类孢子在显微镜下压裂未见明显孢壁层数,部分孢子有分泌物渗出(表2,图1)。目前,经实验观察的孢子均未见Melzer’s染液染色反应。5种高山栎根系土壤样本中孢子密度分别为GSL2(205.49)>GSL4(178.90)>GSL1(88.39)>GSL3(43.84)>GSL5(16.16)个·g−1,不同高山栎土壤样本具有明显差异,且呈乔木高山栎大于灌木的趋势(图2),其中,GSL3为灌木但表现出孢子密度相对较低的特征。各样本孢子100目下(直径>165 μm)以黑色硬质孢子为主,多数孢子密集分布于300目筛(50~74 μm)内,呈深棕色。
采集树种
Tree species孢子编号
Spore NO.孢子颜色
Spore color孢子形状
Spore shape孢子直径/
um
Diameter
of spore孢壁层数
Spore
wall
layersMelzer’s
染色反应
staining
reaction其他特征
Other features高山栎Quercus
semicarpifolia Smith
(乔木)GSL1-001 黑色 近圆形 130~160 — — 整体通黑、质硬,压裂后
未能明显分辨包子层数GSL1-003 深棕黑色 近球形 110~140 1 — 孢子质软,有内含物 GSL1-005 棕褐色 球形或近球形 70~100 2 — 孢子壁较厚,颜色由
外及里发生渐变GSL1-007 深黄色 球形 90~130 2 — 孢子壁界限清晰,有内含物 长穗高山栎
Quercus longispica (Hand.-Mazz.)
A. Camus(灌木)GSL2-008 黑色 球形或近球形 130~170 — — 质硬、表面有轻微
凸起并有内含物GSL2-010 棕色或暗棕色 圆形至近圆形 120~150 2 — 孢子壁光滑、分层明显 GSL2-012 深棕色 椭圆形 50~80 2 — 表面不光滑且有少量覆
盖物孢内含分泌物GSL2-014 深棕色至棕黑色 圆形至近椭圆形 80~110 2 — 孢表面有明显双层网纹,
网孔呈不规则多边形刺叶高山栎
Quercus spinosa David
ex Franch.(灌木)GSL3-007 黑色 球形或近球形 80~100 1 — 表面粗糙,具分泌物
且具网状结构GSL3-009 深棕色 近球形或椭圆 70~100 1 — 表面光滑,可见
纹路零散分布GSL3-010 黑色 椭圆形、近球形 50~70 — — 黑色,孢壁破损后未见
明显孢子壁及分层
川滇高山栎
Quercus aquifolioides
Rehd. et Wils(灌木)GSL4-003 深棕至红棕色 圆形或近圆形 60~90 2 — 内含物为无色透明似油滴状 GSL4-004 深棕至黄棕色 球形或近球形 60~90 2 — 孢壁界限明显,表面不光滑 GSL4-006 深棕色 球形至近球形 100~120 1 — 表面光滑,有覆盖物 GSL4-00Y 黑褐色 近球形 120~150 2 — 表面光滑孢子壁界限,颜色较
浅,内容物为深棕黑色高山栎Quercus
semicarpifolia Smith
(巨大乔木)GSL5-004 黑色 近球形或不规则 160~220 3 — 质硬易碎、实心;压破
孢子孢壁未见明显分层GSL5-006 黑色 球形至近球形 120~160 3 — 孢壁未见明显分层且不光滑 GSL5-008 黑色 近球形或卵形 50~75 2 — 压破未见明显孢壁分层 GSL5-012 深棕至暗棕红 近球形 100~130 1 — 孢壁较厚,内含分泌物 GSL5-016 棕色至深棕色 球形或近球形 280~480 2 — 可见孢子梗 云南香格里拉高山栎
Quercus spp.GA 棕至深棕褐色 近橄榄球型 75~90 3 — 表面光滑,具有内含物 GB 深棕至黑色 球形 55~75 3 — 具内含物,可见孢子梗 Table 2. Morphological characteristics of soil AMF in roots of several Quercus alpine
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对西藏、四川各高山栎根围土壤中的AMF分子鉴定结果表明:横断山脉不同海拔地区采集的高山栎土壤AMF均与类球囊霉科(Paraglomeraceae)类球囊霉属(Paraglomus)具有较近的亲缘关系(表3)。经西弗吉尼亚大学孢子比对网站(occultum | Davis - INVAM | West Virginia University (wvu.edu))比对发现,Paraglomus属下目前收录的菌种仅有巴西类球囊霉 (Paraglomus brasilianum (Spain & J. Miranda) J.B. Morton & D. Redecker)和隐类球囊霉(Paraglomus occultum (C. Walker) J.B. Morton & D. Redecker),但这2种AM 孢子在颜色、质地、孢壁层数与Melzer’s染液反应效果与目标菌种均明显不同。利用Mycobank检索AMF Paraglomus属,选取Gosling等[22]和Mello等[23]发表的AMF Paraglomus属的几种序列以及MAARJAM (ut.ee)中与本研究孢子相似度高于90%(相似度为90.9%~99.2%)的序列对几种高山栎林下AMF孢子进行系统发育树构建。结果表明:明确到种的Paraglomus序列聚为一支,MAARJAM (ut.ee)中Paraglomeraceae Paraglomus sp.属序列与样本GSL2-014聚为一支(图3),其余所有孢子与根系AMF克隆样本能够单独聚为一支,其中,同源序列相似度高于97%[24]的个体极有可能为类球囊霉属内某种真菌。
树种
species采集地
collected location菌株号
Strains No.GenBank中相近菌株
Nearest type strainGenBank登录号
Accession No.相似度
Identity/%科
Family属
Genus高山栎
Quercus
semicarpifolia西藏林芝察隅
国道219旁2610 mGSL1-001 类球囊霉科
ParaglomeraceaeParaglomus sp. LT935278 97.2 GSL1-003 Paraglomus sp. LT935278 99.2 GSL1-005 Paraglomus IH1
VTX00444LT983307 99.2 GSL1-007 Paraglomus sp. LT935278 96.1 长穗高山栎
Quercus
longispica西藏林芝察隅
国道559旁3440 mGSL2-008 Paraglomus sp. LT935278 97.2 GSL2-010 Paraglomus IH1
VTX00444LT935278 98.0 GSL2-012 Paraglomus IH1
VTX00444LT983306 98.5 GSL2-014 Paraglomus IH1
VTX00444LT984328 91.7 刺叶高山栎
Quercus
spinosa四川阿坝马尔康县
梦笔山3630 mGSL3-007 Paraglomus IH1
VTX00444LT983306 98.6 GSL3-009 Paraglomus sp. LT935278 95.8 GSL3-010 Paraglomus sp. LT935517 96.3 川滇高山栎
Quercus
aquifolioides四川阿坝巴郎山
国道310旁3540 mGSL4-003 Paraglomus IH1
VTX00444LT984234 93.3 GSL4-004 Paraglomus sp. LT935517 96.5 GSL4-006 Paraglomus sp. LT935482 93.9 GSL4-00Y Paraglomus IH1
VTX00444LT984234 90.9 (巨大乔木)高山栎
Quercus
semicarpifolia西藏林芝察隅国道
桑久村219旁GSL5-004 Paraglomus IH1
VTX00444LT983016 91.3 GSL5-006 Paraglomus sp. LT935278 96.4 GSL5-008 Paraglomus sp. LT935278 96.2 GSL5-012 Paraglomus IH1
VTX00444LT983306 98.6 GSL5-016 Paraglomus sp. LT935517 95.6 高山栎
Quercus
semicarpifolia西藏林芝察隅
国道219旁2610 mGSL1-a Paraglomus IH1
VTX00444LT983016 90.3 川滇高山栎
Quercus
aquifolioides云南香格里拉奔子栏镇附近 GSL4-a Paraglomus sp. LT935482 92.9 注:GSL1-a、GSL4-a为根系克隆结果比对,其余为AMF孢子序列比对
Note: GSL1-a and GSL4-a were the comparison of root clone results, and the rest were the comparison of AMF spore sequencesTable 3. Comparison of sequence information of each alpine oak AMF with that in GenBank
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利用AMF特异引物AML1、AML2对香格里拉地区的高山栎根系潜在AMF的ITS片段DNA克隆,结果表明:经75%浓度酒精对高山栎根系表面消毒30 s后,其根系表面仍存在AMF的DNA。通过MAARJAM (ut.ee)网站比对发现,存在真菌普遍与球囊霉属Glomus在Genbank中的标准序列相似度较高,部分目标菌种序列与Genbank中的序列对比有相似度较高的类球囊霉属Paraglomus序列存在(表4),但其在覆盖度(Query coverage)或最大识别度(Max identity)2个指标并非最高。利用Bio-edit软件检验克隆所得目标AM菌种同源性,发现17个菌种均为同一菌株,故选择G1为代表,与该样本下AMF孢子序列(GA、GB)一同构建系统发生演化树(图4),分析表明:目标菌种样品G1、GA和GB与Glomus versiforme(Y17651.1)聚为一支,说明其亲缘关系与该属较近,置信度可达98%,推测高山栎能够和与Glomus versiforme同源性较高的AMF形成共生关系,且其与林下菌塘孢子类似,二者均未能鉴定到种。说明能够与香格里拉地区高山栎根系共存的AMF极可能为球囊霉属和类球囊霉属,或与其并列的某一新属真菌。
树种
species采集地
collected location孢子/菌株号
Strains No.GenBank中相近菌株
Nearest type strainGenBank登录号
Accession No.相似度
Identity/%科
Family属
Genus(乔木型)高山栎
Quercus semicarpifolia
(not identified)云南香格里拉奔子栏镇 GA 球囊霉科
GlomeraceaeGlomus sp. VTX00301 KC579428 98.1 GB Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 (乔木型)高山栎
Quercus semicarpifolia
(not identified)云南香格里拉奔子栏镇 G1 球囊霉科
GlomeraceaeGlomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 G2 Glomus sp. VTX00113 JX144124 98.9 G3 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 G4 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 G5 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 G6 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 G7 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 G9 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 G10 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 G11 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 G12 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 G15 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 G16 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 G17 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0 注:GA、GB为香格里拉高山栎样点孢子的18S rRNA基因扩增结果,与根系克隆结果形成对照
Notes: GA、GB was the result of amplification of 18S rRNA gene from the spores of Quercus shangrilaTable 4. Comparison of AMF clones in roots of Quercus alpine and AMF spores in soil in Shangri-La area
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几种高山栎根系苯胺蓝染色结果表明:100~200倍放大时可见明显的类泡囊和丛枝结构,此类结构在高山栎根系内主要呈圆形或近圆形(图5a、b),部分呈椭圆形,部分泡囊分布密集,并伴随“向无规则方向伸展”的横向菌丝结构,推测其为高山栎根系于AMF共生所形成的泡囊和丛枝。
Investigation of Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) in Several Alpine Oak Understory Forests in the Subalpine Zone of the Hengduan Mountains
- Received Date: 2022-04-08
- Accepted Date: 2022-06-01
- Available Online: 2023-02-20
Abstract: