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杨属(Populus L.)植物分布广泛,不仅具有较高的经济和生态价值,同时也是木本模式植物,在林木分子生物学研究等方面具有重要作用。然而,作为北方城市重要的道路绿化和城市景观树种,杨树在提高城市绿化水平的同时,也因其花粉在每年春季大量飘散而引起了一定的植源性污染问题。杨树雄株散落的花粉以空气为传播媒介,通过人体呼吸及皮肤接触造成呼吸道疾病和皮肤过敏等问题,危害着人体健康[1-3]。除更换树种外,目前关于花粉污染的应对策略主要还包括人工喷水增湿、增强地表对花粉的吸附能力等。另外,日益发展的生物技术推动了林木遗传育种进程,有望成为解决花粉等植源性污染的有效途径之一。目前关于杨树的研究主要聚焦于其材性及抗逆性等方面,而对杨树的生殖发育研究相对较少。
杨树童期较长且雌雄异株,不同于大多数由萼片、花瓣、心皮(雌蕊/雄蕊)、胚珠4轮结构组成的被子植物花,杨树的雌花和雄花均高度简化,其中,雄花着生于苞片腋间,由退化的盘状花被和雄蕊构成,花药为黄色或红色,一般情况下药隔无明显突出[4]。花药为四孢型,成熟的花药壁由一层表皮、一层内层、两层中层和单层绒毡层组成。表皮宿存,内层发育成纤维状增厚,中层是短命的,其中一层在小孢子阶段变为扁平,最后被挤碎,另一层则在花药开裂前解体;绒毡层细胞早期是单核的,而当花粉母细胞减数分裂时则成为双核或多核的,它们在花粉单核时期开始退化,至双核期消失[5]。杨树性别特异的花器官发育是一个复杂的过程,但与其他被子植物花发育类似,杨树的花发育也分为开花诱导、花的发端和花器官发育3个受众多基因调控的复杂过程,且它们具有相似的花器官特性基因[6]。
随着研究的不断深入,花器官形成的相关理论逐步完善,由最初的“ABC”模型假说发展成为“ABCDE”模型及四聚体模型,其中,A类和E类基因决定花萼特征,A、B和E类基因一起调控花瓣发育,B、C和E类基因共同决定雄蕊发育,C类和E类基因决定心皮发育,D类和E类决定胚珠发育[7-8]。杨树花发育的相关器官特异性基因的作用不全同于其他开花植物,近年来调控杨树花器官发育的多个ABCDE类基因功能被解析,如:A类基因中的AP1同源基因PTM1、PTM2和B类基因中的AP3同源基因,它们在杨树雌/雄株中的表达有所差异,可能参与了杨树的性别决定[9-10];B类基因中的PI的同源基因PdPI和C类基因PTAG1和PTAG2,与杨树花发育密切相关并且可能影响营养器官的形成和发育[6, 11-12];E类基因中的PTM3、PTM4及PTM6,在杨树雌/雄株中花发育过程中持续表达,在胚珠、花药原基中有着非常高的表达量[13]。
AGAMOUS (AG)是MADS-box基因中研究较为充分的一类基因,属于植物特有的MIKC型C类MADS-box基因,包括euAG/PLENA (PLE)谱系和AGAMOUS-like11(AGL11)谱系,可与其他基因互作共同控制雄蕊及心皮的发育[8, 14-17]。在拟南芥中,AG可控制拟南芥花发育后期的花粉形成[18-20]。另有研究表明,在拟南芥AG突变体的花器官四轮结构中出现了第三轮结构(雄蕊)转化为花瓣、第四轮结构(心皮)发育成一个新的花的情况,而第一、二轮的花结构(萼片及花瓣)与野生型拟南芥花器官并无差异[21-23]。另外,抑制AG会导致菠菜雄性不育[24]。而AGAMOUS (AG)及其同源基因在单性花发育的研究中鲜有报道,在毛果杨雌株中,AG(PtAG1及PtAG2)和STK(AGL11)基因在杨树种毛发育中表现出较强的功能保守性,共同抑制种毛的形成[12],而该基因在杨树雄花花发育中的作用尚无报道。
本研究基于AG2在被子植物花器官的决定作用,对银腺杨‘84K’(Populus alba × P. glandulosa ‘84K’)PagAG2基因时空特异性进行了检测,为进一步研究其在杨树雄花花发育中的功能,进而有针对性地对杨树生殖发育进行调控奠定基础。
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银腺杨‘84K’(Populus alba × P. glandulosa ‘84K’)花序于2019年2月22日采自北京市中国林科院内(115.7°~117.4° E,39.4°~41.6° N),组培材料生长于温度25℃、光强2300 Lx、光周期16 h/8 h的组织培养间中;RNA提取试剂盒购自Aidlab公司(北京);Premix TaqTM酶购、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自Takara公司(日本);固定液由50%FAA固定液100 mL、无水乙醇50 mL、37%甲醛溶液10 mL、冰乙酸5 mL加DEPC·H2O定容至100 mL;RNA预杂交液/杂交液由20 × SSC 30 mL、50 × Denhardt's 10 mL、10%SDS 5 mL、10 mg· mL−1Salmon DNA 1 mL、Formamide(甲酰胺)50 mL、ddH2O 4 mL,充分混匀后使用0.45 μm滤膜去杂质后使用;抗荧光淬灭封片剂购自生工生物公司(上海)。
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取‘84K’杨越冬花枝,2019年2月22日置于温室水培(0 d),每日更换一次水。对水培后1周内的花序连续采样(0、3、4、5、6、7 d),置于PBS固定液中立即真空抽气固定,并依次完成脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、粘片、脱蜡步骤,以番红—固绿法染色[25]。染色完成染色后,在光学显微镜(OLYMPUS公司(BX51)产品)下观察、拍照记录。
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分别提取‘84K’杨组培苗的根、茎、叶及水培后2周内的花序连续采样(水培后0、3、4、5、6、7 d的花序)的总RNA,并反转录合成cDNA。使用荧光定量PCR仪(Roche公司(Light Cycle 480Ⅱ)产品)进行qRT-PCR反应,反应体系为cDNA模板2 μL,Primer-F(10 μmol·L−1) 0.8 μL,Primer-R(10 μmol · L−1) 0.8 μL,XTB Green Premix TaqII(TliRNaseH Plus,2 × )10 μL,ddH2O补足至20 μL。其扩增条件为预变性95℃,30 s;变性95℃,5 s,退火60℃,30 s,40个循环;熔解曲线为95℃ 5 s,65℃ 1 min。以Actin为内参基因,每个样品进行3次重复,用2−ΔΔCT算法进行分析[26],引物见表1。
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基于碱基互补的原则,利用荧光原位杂交技术将细胞原位杂交技术和荧光技术有机结合,用荧光素标记的已知外源RNA作探针,与‘84K’杨雄花组织切片杂交,与待测核酸的靶序列专一性结合,通过检测杂交位点荧光来显示PtAG2核苷酸序列在‘84K’杨雄花中的位置。根据待检测目的基因序列,采用Primer Premier 6.0软件设计,并用探针合成仪器(UNICORN 5.31,沃特曼)合成RNA探针(表2),荧光素标记反义RNA核酸探针,以正义RNA探针为阴性对照。将‘84K’杨雄花序样品放入配制好的固定液(50%FAA固定液100 mL、无水乙醇50 mL、37%甲醛溶液10 mL、冰乙酸5 mL,加DEPC·H2O定容至100 mL)中固定12 h后经梯度酒精脱水后浸蜡、包埋、切片(SQ2125,徕克公司)、摊片(PPTHK-21B,徕克)、捞片,62℃烤箱烤片2 h。石蜡切片脱蜡后,将切片于修复液中煮沸10~15 min,自然冷却。滴加蛋白酶K(20 ug· mL−1)37℃消化,纯水冲洗后PBS洗3次,每次5 min。滴加预杂交液,37℃于杂交仪(S500-24,ThermoBrite)孵育1 h。倾去预杂交液,滴加探针杂交液,置于恒温箱57℃度杂交过夜。洗去杂交液,2×SSC,37℃洗10 min,1×SSC,37℃洗2次,每次5 min,0.5×SSC室温洗10 min。切片滴加DAPI染液,避光孵育8 min,冲洗后滴加抗荧光淬灭封片剂(Anti-Fade Mounting Medium,生工)封片,置于荧光显微镜下(CX41,OLYMPUS)观察并采集图像(紫外激发波长330~380 nm,发射波长420 nm,发蓝光;FAM(488)绿光激发波长465~495 nm,发射波长515~555 nm,发绿光;CY5红光激发波长510~560 nm,发射波长590 nm,发红光)。所有试剂、仪器均需DEPC处理。
基因 Gene 产物长度 Amplification Length/bp 引物序列 Primer sequence 用途 Usage Actin 195 F: 5′-AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG -3′ Internal
referenceR: 5′-GCATCATCACAATCACTCTCCGA -3′ PagAG2 270 F: 5′-GCTTCTCCGAGCAAAGGTCT-3′ qRT-PCR R: 5′-GCAGGCGGCAATCCATTAAC -3′ Table 1. Primers used in qRT-PCR analysis
基因 Gene 序列 Sequence 荧光标记 Fluorescence labeling PagAG2 5'-AUUAUCUGUUCUUUGCGAUGCUGAGGUUGC-3' 5’CY5修饰 红色
(阴性对照)5'-UAAUAGACAAGAAACGCUACGACUCCAACG-3' 5’FAM修饰 绿色 Table 2. RNA probe sequences
Spatiotemporal Expression Analysis of PagAG2 Gene in Populus alba × P. glandulosa '84K'
- Received Date: 2021-02-07
- Accepted Date: 2021-09-23
- Available Online: 2021-12-20
Abstract: