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蒙古栎(Quercus mongolica Fisch. ex Ledeb.)为壳斗科(Fagaceae)栎属落叶乔木,广泛分布于我国东北和华北地区,是落叶栎类中最耐寒和耐旱树种,具有较高的生态和经济价值[1]。生产中,蒙古栎多以种子进行播种繁殖,致使优良性状不能稳定遗传,林分质量得不到保证,无法形成高经济价值林木,进而影响蒙古栎开发利用和产业化进程[2]。
无性繁殖是树木良种规模化推广的重要途径,其中扦插应用最广泛。插穗能否生根是决定扦插成功的关键。栎树插穗内含有大量酚类等阻碍生根的物质,属于极难生根树种[3]。植物生长调节剂能显著促进栎树插穗生根。例如:栓皮栎(Quercus variabilis Blume)插穗经1 000 mg·L−1 IBA速蘸处理后,生根率可达34.07%,比对照组提高5.2倍[4];北美红栎(Quercus rubra L.)插穗经400 mg·L−1 ABT1浸泡6 h后,生根率从0提高到16.7%[5];苏玛栎(Quercus shumardii)插穗在0.5 mg·L−1的IBA溶液中浸泡1 h,生根率可达24.2%[6]。
除植物生长调节剂,其它外源物质近些年被证明在促进插穗生根中发挥重要作用,但对栎树扦插效果及机制不清楚。发根农杆菌可诱导毛状根形成,利用该特性可促进苹果、大叶金叶椴、亚美马褂木等多种植物插穗生根[7]。亚美马褂木(Liriodendron sino-americanum)插穗经A4发根农杆菌菌液(OD600 = 0.5)处理后,生根率可提高43.4%。糠锻(Tilia mandschurica Rupr.er Maxim.)插穗经30 148发根农杆菌(OD600 = 1.0)结合IBA浸泡处理,生根率可达88.9%[8]。
丙环唑(PCZ)是油菜素甾醇合成抑制剂,参与植物激素信号调控。有研究表明,PCZ参与毛竹根基因表达调控,从而影响细胞壁、过氧化氢代谢分解和生长素相关基因表达[9]。基于烟草和棉花幼苗相关研究发现,适宜浓度PCZ可促进根径生长[10]和侧根数增多,并提高生根过程中的相关酶活性[11]。然而,PCZ是否能够促进植物插穗生根未知。
蒙古栎为扦插极难生根树种,目前尚未有成熟扦插技术报道,插穗生根机理不明确。探明植物扦插生根调控机理是提高植物插穗生根率的关键。在扦插生根过程中,营养物质、内源激素和酶的动态变化发挥重要调控作用[12]。本研究以蒙古栎当年生健壮嫩枝为扦插材料,使用不同浓度ABT1、IBA-K、K599发根农杆菌、PCZ及其组合处理,通过比较插穗的生根率、愈伤率、不定根数、根长等生长指标,探究蒙古栎扦插最适外源物质及浓度,揭示蒙古栎插穗难生根难机理,为蒙古栎规模化扦插育苗提供理论与技术指导。
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试验材料采自辽宁省沈阳市高坎镇沈阳农业大学实验基地。插穗选取当年生长势良好、整齐一致、无病虫害嫩枝。插穗修剪成长10~12 cm,保留2片平切口叶。扦插基质选用蛭石和珍珠岩(1:1)。插床使用塑料大棚覆盖,外加70%透光率遮阳网。棚内相对湿度在扦插前期控制在70%~90%,生根后适当减小,温度控制在20~30 ℃。
K599发根农杆菌培养:用接种环蘸取少量甘油菌,在含50 μg·mL−1链霉素的TY平板上连续划动,重复操作2~3次。平板于28 ℃倒置培养2~3 d。挑取单菌落至1.5 mL含有链霉素抗性的LB液体培养基中,28 ℃,200 r·min−1摇菌12~24 h。取1 mL菌液加入到50 mL含有50 μg·mL−1链霉素抗性的LB液体培养基中,28 ℃,200 r·min−1摇床震荡培养5~6 h(OD600约为0.4)、7~8 h(OD600约为0.8)、9 h(OD600约为1.2)。
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使用不同浓度IBA-K(A1:1 500 mg·L−1、A2:3 000 mg·L−1、A3:4 000 mg·L−1)、ABT1(B1:1 500 mg·L−1、B2:3 000 mg·L−1、B3:4 000 mg·L−1)、K599发根农杆菌(C1:OD600 = 0.4、C2:OD600 = 0.8、C3:OD600 = 1.2)、PCZ(D1:10 μmol·L−1、D2:50 μmol·L−1)处理插穗,以清水(CK1)和LB液体培养基(CK2)分别为对照。IBA-K、ABT1和清水处理采用速蘸法、K599菌液和LB液体培养基处理采用浸泡法(30 min)、PCZ处理也采用浸泡法(2 h)。每处理包括30根插穗,各处理3次重复。
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以试验1.2.1结果中植物生长调节剂(IBA-K或ABT1)、发根农杆菌K599及PCZ各外源物质的最佳浓度进行组合处理,其中植物生长调节剂(IBA-K、ABT1)对蒙古栎插穗生根率影响没有显著差异(表2)。由此使用IBA-K(4 000 mg·L−1)、发根农杆菌K599(OD600 = 0.8)、PCZ(50 μmol·L−1)组合处理插穗。组合应用时,外源物质按表1顺序依次处理插穗。插穗在K599菌液与PCZ中采用浸泡法,分别浸泡30 min和2 h,IBA-K中采用速蘸法。每处理包括30根插穗,各处理3次重复。
表 1 不同外源物质组合应用
Table 1. - Combined application of different exogenous substances
组合处理
Combination treatment组合处理中外源物质及浓度
Exogenous substances and concentrations in combination treatmentE1 K599(OD600 = 0.8) + IBA-K(4 000 mg·L−1) E2 PCZ(50 μmol·L−1) + K599(OD600 = 0.8) E3 PCZ(50 μmol·L−1) + K599(OD600 = 0.8) + IBA-K(4 000 mg·L−1) E4 PCZ(50 μmol·L−1) + IBA-K(4 000 mg·L−1) E5 PCZ(50 μmol·L−1) + IBA-K(4 000 mg·L−1) + K599(OD600 = 0.8) 注:各组合处理按表中书写顺序依次处理插穗。例如:E1(插穗先在浓度为0.8的发根农杆菌 K599中浸泡30 min,接着在4 000 mg·L−1 IBA-K中速蘸)
Notes: Each combination processing according to the table in the order of writing processing cuttings. For example: E1 (the cuttings were soaked for 30 min in Agrobacterium rhizogenes K599 at a concentration of 0.8, followed by dipping at a medium speed of 4 000 mg·L−1 IBA-K)表 2 不同外源物质对蒙古栎扦插生根的影响
Table 2. Effects of different exogenous substances on the rooting of Quercus mongolica cuttings
处理
Treatment生根率
Rooting rate/%愈伤率
Callus rate/%不定根数
Root number平均根长
Average root/cm根系效果指数
Root indexA1 3.33 ± 0 dD 16.75 ± 1.95 cBC 2.33 ± 0.33 abAB 8.15 ± 1.35 aA 0.66 ± 0.21 cCD A2 0 dD 7.79 ± 1.12 deCD 0 cC 0 cB 0 dD A3 0 dD 0 eD 0 cC 0 cB 0 dD B1 0 dD 4.45 ± 1.11 eD 0 cC 0 cB 0 dD B2 1.11 ± 1.11 dD 14.50 ± 1.12 cdBC 0.33 ± 0.33 cC 1.90 ± 1.9 bcB 0.06 ± 0.06 dD B3 2.22 ± 1.11 dD 16.75 ± 1.95 cBC 1.33 ± 0.88 bcBC 5.28 ± 2.76 abAB 0.32 ± 0.19 cdD C1 14.50 ± 2.24 bB 36.39 ± 3.14 bA 1.80 ± 0.12 bABC 5.24 ± 0.18 abAB 1.35 ± 0.19 bB C2 24.71 ± 2.29 aA 37.56 ± 2.07 bA 3.07 ± 0.13 aA 6.08 ± 0.05 abAB 4.57 ± 0.23 aA C3 7.79 ± 1.12 cC 22.43 ± 3.01 cB 1.23 ± 0.23 bcBC 4.73 ± 0.23 abAB 0.47 ± 0.15 cdD D1 1.11 ± 1.11 dD 20.14 ± 1.96 cB 0.33 ± 0.33 cC 0.27 ± 0.27 cB 0.01 ± 0.01 dD D2 12.25 ± 1.12 bB 43.62 ± 2.47 aA 1.72 ± 0.03 bABC 4.91 ± 0.10 abAB 1.04 ± 0.09 bBC CK1 0 dD 7.79 ± 2.95 deCD 0 cC 0 cB 0 dD CK2 0 dD 1.11 ± 1.11 eD 0 cC 0 cB 0 dD 注:数据为平均值 ± 标准差,同一列不同大写字母表示不同处理间差异极显著(p < 0.01),不同小写字母表示不同处理间差异显著(p < 0.05)。下同
Notes: The data were showed by mean ± SD. Different capital letters in the same column indicate highly significant differences (p < 0.01), different capital letters indicate significant differences (p < 0.05). The same below -
试验使用50 μmol·L−1 PCZ浸泡2 h的插穗为处理组、清水浸泡2 h的为对照组。每处理300个插穗,3次重复。基于蒙古栎插穗生根特点,扦插过程中每10 d进行一次取样,共取7次。每次取样时将穗条附着基质清洗干净,擦干后快速取下基部2~3 cm韧皮部,剪碎混匀后液氮速冻,并于−80 ℃保存。
生根过程各时期韧皮部可溶性糖含量、淀粉含量、过氧化物酶(POD)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性测定参照张志良[13]等人的方法。蛋白质含量测定参照李合生[14]的方法。多酚氧化酶(PPO)活性测定参照李忠光等[15]的方法。吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)和玉米素核苷(ZR)含量,均采用酶联免疫法(ELISA)测定,酶联免疫法(ELISA)试剂盒购自武汉纯度生物科技有限公司。每测定包括3次重复。
使用SPSS 26.0 进行单因素方差和多重比较分析,分析前对百分率数值进行反正弦转换(sin−1)。数据可视化使用Origin 2021和R进行。
不同外源物质对蒙古栎插穗生根及基部生理生化的影响
Effects of Different Exogenous Substances on Rooting, Basal Physiology and Biochemistry of Quercus mongolica Cuttings
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摘要:
目的 扦插是苗木良种繁育的一种重要途径,适宜外源物质的应用能促进插穗生根。蒙古栎扦插生根困难,探究不同浓度外源物质及其组合应用对蒙古栎嫩枝扦插生根的影响,为蒙古栎规模化扦插育苗提供技术支持。 方法 采用速蘸法或浸泡法,使用不同浓度吲哚丁酸钾(IBA-K)、生根粉(ABT1)、K599发根农杆菌、丙环唑(PCZ)及其组合应用处理插穗,测定插穗生根率、愈伤率、生根数、根长、营养物质含量、酶活性和内源激素含量变化等。 结果 不同外源物质单独处理时,K599发根农杆菌(OD600 = 0.8)浸泡30 min后插穗生根率最高,可达24.71%。50 μmol·L−1 PCZ浸泡2 h后插穗根部愈伤率最高,达43.62%。其它外源物质单独处理时,插穗生根效果差。不同外源物质组合应用时,50 μmol·L−1 PCZ浸泡2 h结合K599发根农杆菌(OD600 = 0.8)浸泡30 min可显著提高蒙古栎插穗生根,生根率可达36.37%,愈伤率达51.14%,平均生根数及根长分别为2.25和5.72 cm。此外,研究结果表明,PCZ能够加快插穗生根过程中可溶性糖和蛋白消耗,促进过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性,提高不定根诱导期IAA含量,增加IAA/ABA和 IAA/ZR比值。 结论 PCZ结合发根农杆菌K599组合应用能够显著提高蒙古栎嫩枝扦插生根率。营养物质(可溶性糖、蛋白)消耗慢、抗氧化酶(PPO、POD)活性弱、IAA含量低可能是蒙古栎扦插生根难的主要原因,而PCZ对此具有重要抑制作用,可在蒙古栎等扦插难生根物种中发挥重要作用。 Abstract:Objective Cutting propagation is an important way to propagate excellent seedlings, and the application of suitable exogenous substances can promote rooting of cuttings. The rooting of Quercus mongolica cuttings is difficult. Exploring the effects of different concentrations of exogenous substances and their combine applications on the rooting of Quercus mongolica softwood cuttings can provide technical support for large-scale propagation by cutting propagation. Method Using rapid dipping or soaking methods, different concentrations of indole butyrate potassium (IBA-K), rooting powder (ABT1), K599 Agrobacterium rhizogenes, propiconazole (PCZ), and their combination were used to treat cuttings. The rooting rate, callus rate, rooting number, root length, nutrient content, enzyme activity, and changes in endogenous hormone content of cuttings were measured. Result When different exogenous substances were used separately, the rooting rate of K599 Agrobacterium rhizogenes (OD600 = 0.8) was the highest after soaking for 30 minutes, reaching 24.71%. After soaking in 50 μM PCZ for 2 hours, the root callus rate of cuttings was the highest, reaching 43.62%. For other exogenous substances alone, the rooting effect of cuttings was poor. When different combinations of exogenous substances were used, 50 μmol·L−1 PCZ soaking for 2 hours combined with K599 Agrobacterium rhizogenes (OD600 = 0.8) soaking for 30 minutes significantly improved the rooting rate of Quercus mongolica cuttings, reaching 36.37% for rooting and 51.14% for callus. The average number of roots and root length were 2.25 and 5.72 cm, respectively. In addition, the results indicated that the use of PCZ can accelerate the consumption of soluble sugars and proteins during the rooting process of cuttings, promote the activities of peroxidase (POD) and polyphenol oxidase (PPO), increase the content of IAA during the induction period of adventitious roots, and increase the IAA/ABA and IAA/ZR ratios. Conclusion The combined application of PCZ and Agrobacterium rhizogenes K599 can significantly improve the rooting rate of Quercus mongolica softwood cuttings. Slow consumption of nutrients (soluble sugars, proteins), weak activity of antioxidant enzymes (PPO, POD), and low content of IAA may be the reasons of the difficulty in rooting of Quercus mongolica cuttings. PCZ has an important inhibitory effect on this, and can play an important role in difficult rooting species such as Quercus mongolica cuttings. -
Key words:
- cutting propagation
- / Agrobacterium rhizogenes
- / propiconazole
- / rooting mechanism
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表 1 不同外源物质组合应用
Table 1. - Combined application of different exogenous substances
组合处理
Combination treatment组合处理中外源物质及浓度
Exogenous substances and concentrations in combination treatmentE1 K599(OD600 = 0.8) + IBA-K(4 000 mg·L−1) E2 PCZ(50 μmol·L−1) + K599(OD600 = 0.8) E3 PCZ(50 μmol·L−1) + K599(OD600 = 0.8) + IBA-K(4 000 mg·L−1) E4 PCZ(50 μmol·L−1) + IBA-K(4 000 mg·L−1) E5 PCZ(50 μmol·L−1) + IBA-K(4 000 mg·L−1) + K599(OD600 = 0.8) 注:各组合处理按表中书写顺序依次处理插穗。例如:E1(插穗先在浓度为0.8的发根农杆菌 K599中浸泡30 min,接着在4 000 mg·L−1 IBA-K中速蘸)
Notes: Each combination processing according to the table in the order of writing processing cuttings. For example: E1 (the cuttings were soaked for 30 min in Agrobacterium rhizogenes K599 at a concentration of 0.8, followed by dipping at a medium speed of 4 000 mg·L−1 IBA-K)表 2 不同外源物质对蒙古栎扦插生根的影响
Table 2. Effects of different exogenous substances on the rooting of Quercus mongolica cuttings
处理
Treatment生根率
Rooting rate/%愈伤率
Callus rate/%不定根数
Root number平均根长
Average root/cm根系效果指数
Root indexA1 3.33 ± 0 dD 16.75 ± 1.95 cBC 2.33 ± 0.33 abAB 8.15 ± 1.35 aA 0.66 ± 0.21 cCD A2 0 dD 7.79 ± 1.12 deCD 0 cC 0 cB 0 dD A3 0 dD 0 eD 0 cC 0 cB 0 dD B1 0 dD 4.45 ± 1.11 eD 0 cC 0 cB 0 dD B2 1.11 ± 1.11 dD 14.50 ± 1.12 cdBC 0.33 ± 0.33 cC 1.90 ± 1.9 bcB 0.06 ± 0.06 dD B3 2.22 ± 1.11 dD 16.75 ± 1.95 cBC 1.33 ± 0.88 bcBC 5.28 ± 2.76 abAB 0.32 ± 0.19 cdD C1 14.50 ± 2.24 bB 36.39 ± 3.14 bA 1.80 ± 0.12 bABC 5.24 ± 0.18 abAB 1.35 ± 0.19 bB C2 24.71 ± 2.29 aA 37.56 ± 2.07 bA 3.07 ± 0.13 aA 6.08 ± 0.05 abAB 4.57 ± 0.23 aA C3 7.79 ± 1.12 cC 22.43 ± 3.01 cB 1.23 ± 0.23 bcBC 4.73 ± 0.23 abAB 0.47 ± 0.15 cdD D1 1.11 ± 1.11 dD 20.14 ± 1.96 cB 0.33 ± 0.33 cC 0.27 ± 0.27 cB 0.01 ± 0.01 dD D2 12.25 ± 1.12 bB 43.62 ± 2.47 aA 1.72 ± 0.03 bABC 4.91 ± 0.10 abAB 1.04 ± 0.09 bBC CK1 0 dD 7.79 ± 2.95 deCD 0 cC 0 cB 0 dD CK2 0 dD 1.11 ± 1.11 eD 0 cC 0 cB 0 dD 注:数据为平均值 ± 标准差,同一列不同大写字母表示不同处理间差异极显著(p < 0.01),不同小写字母表示不同处理间差异显著(p < 0.05)。下同
Notes: The data were showed by mean ± SD. Different capital letters in the same column indicate highly significant differences (p < 0.01), different capital letters indicate significant differences (p < 0.05). The same below -
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