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植物在生长发育过程中会遭受多种生物与非生物胁迫,其中干旱胁迫是植物面临的主要非生物胁迫之一[1-2]。在干旱胁迫下,植物体内活性氧(ROS,reactive oxygen species)等次生代谢物积累,损伤植物细胞结构;影响植物体内叶绿素合成,植物光合能力减弱;影响植物生长发育,降低植物产量[3-4]。研究植物响应干旱胁迫的分子机制,提高植物抗旱性,对生态环境建设、国民经济发展具有重要意义。
植物响应干旱胁迫的生理和分子机制在模式植物拟南芥和作物中研究较多、较深入,研究表明,在22 ℃,12 h光照/12 h黑暗条件生长3周的拟南芥,停止浇水干旱处理约2周,观察表型发现野生型拟南芥生长未受到影响[5];同样的生长条件,生长10 d的单子叶植物玉米,停止浇水后约一周,可以观察到叶片萎蔫[6]。多年生木本植物由于个体大、世代周期长等原因,使得其生理和分子机制的研究相对困难;同时,由于多年生木本植物具有规律的生长周期、次生维管组织复杂等特性,其生物学特性与一年生草本植物的差异非常大[7]。因此,以多年生林木为研究对象,探究其对干旱胁迫的响应机制,不仅能够为林木响应干旱胁迫的研究提供理论基础,也有助于科学培育苗木,为培育耐旱林木新品种提供理论支撑。
中国是森林资源贫乏的国家,每年国家需要进口大量木材才能满足经济建设,通过使用丰产栽培方式种植速生树种,是在短期内解决国家木材短缺的重要途径。杨树用途广泛,不仅用于防护林、生态林建设,也用于工业用材[8]。在毛果杨中研究发现,PtrSWRA复合体所催化的H3K4me3修饰,对于维持杨树的耐旱性具有至关重要的作用[9];在欧美杂交杨中研究发现,在干旱胁迫下PdGNC的表达升高,PdGNC能够直接上调PdHXK1表达,激活的PdHXK1进而增加己糖激酶活性来促进保卫细胞中NO和H2O2的积累,触发气孔关闭,从而提高植株水分利用率和干旱耐受性[10]。作为白杨派的银白杨,广泛分布于我国西北、华北等地,其树干通直,成材快,但在其生长过程中会遭受干旱、盐碱、病虫害等生物与非生物胁迫。目前银白杨已经具有高质量基因组数据和转化体系[11-12]。深入研究银白杨响应干旱胁迫的分子机制,对了解干旱胁迫对多年生树木的影响具有重要意义。
本文以在土里生长5周的银白杨幼苗为研究对象。通过干旱胁迫处理银白杨幼苗,并对银白杨生长变化,生理、生化指标检测,基因表达变化进行分析。解析银白杨响应干旱胁迫的生理机制,为科学培育苗木提供理论指导。
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取在温室中正常培养5周、高度约36 cm,长势一致且健壮的银白杨植株,将其完全浇透水后,放置在正常生长条件下培养,并停止浇水,开始干旱处理,从这一天(0 d)开始直至干旱处理至12 d,每隔1 d随机选4棵幼苗,取其第6片叶片,进行叶片相对含水量的测定。首先,测量取得的叶片的鲜质量,然后,将叶片置于无菌去离子水中浸泡12 h,取出并擦干水分,称取叶片的饱和鲜质量。最后,将叶片置于65 ℃烘箱中进行烘干,直至叶片质量恒定。叶片相对含水量的计算公式如下:
$ W C=\left(W_{\mathrm{F}}-W_{\mathrm{D}}\right) /\left(W_{\mathrm{T}}-W_{\mathrm{D}}\right) \times 100 {\text{%}} $
式中:WC为叶片相对含水量,WF为鲜质量,WD为干质量,WT为饱和鲜质量
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在银白杨干旱处理的第0、4、8和12 d,分别随机取4株银白杨的第5片叶片进行气孔开度观察。在第5片叶片的中心位置避开叶脉随机取约4 mm
$ \times $ 4 mm大小叶片,立即放入2.5%戊二醛溶液进行固定,并对叶片进行抽真空处理,叶片固定24 h;将固定好的叶片使用0.1 mol·L−1 pH7.2的磷酸缓冲液清洗样品3次;接着依次使用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇进行梯度处理,每个梯度处理15~20 min,全程在冰上进行。脱水处理后的样品使用全自动临界点干燥仪对样品进行干燥。干燥后的样品使用扫描电镜进行气孔开度观察。 -
在银白杨干旱处理的第0、2、4、6、8、10和12 d,分别随机取4株银白杨植株,取其第7片叶片进行叶绿素a,叶绿素b和总叶绿素含量的测定。利用植物叶绿素含量检测试剂盒(货号:BC0990,索莱宝,北京)提取银白杨叶片的叶绿素。利用酶标仪进行叶绿素含量的测定,分别测量叶绿素提取液在663 nm和645 nm波长下的吸光度值。叶绿素a,叶绿素b和总叶绿素含量的计算公式分别为:
$ \begin{aligned} C_{\text {Chla }}=\left(12.7 \times A_{663}-2.69 \times A_{645}\right) \times F \div W \text {; } \\ C_{\text {Chlb }}=\left(22.9 \times A_{645}-4.68 \times A_{663}\right) \times F \div W \text {; } \\ C_{\text {Chla + b }}=\left(20.21 \times A_{645} + 8.02 \times A_{663}\right) \times F \div W \\ \end{aligned} $
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为了检测不同干旱处理时间下,银白杨叶片中ROS含量的差异,本研究以干旱处理0、4、8和12 d的银白杨植株的第5片叶为材料进行研究。将所取的不同干旱处理天数的银白杨叶片置于1 mg·mL−1的DAB染液(pH3.8)中暗处理24 h后,在室温下将叶片用100%乙醇脱色3 h,95%乙醇煮沸约10 min至叶片不再变色。拍照,比较不同干旱处理天数的叶片的颜色,ROS含量越高,颜色越深。
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在银白杨干旱处理的0、2、4、6、8、10和12 d分别随机选取3棵植株的第4片叶放在液氮中保存。利用这些材料进行ABA和IAA含量的测定。测定时,将样品用冷冻干燥机进行冻干,每份样品精密称量20 mg干燥粉末后加入1 mL 80%甲醇水溶液,并加入两种植物激素稳定同位素内标[13C]6-IAA和[2H]6-ABA(OlChemIm Company, Czech Republic)。4 ℃提取3次,收集提取液。提取液经真空浓缩后加入1 mL去离子水,离心取上清,加入含5%乙酸的乙酸乙酯萃取,收集萃取液。萃取液经真空离心干燥机干燥,然后加入10 µL吡啶和40 µL BSTFA,80 ℃反应30 min,加入50 µL正己烷进行质谱分析。
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为了研究银白杨受干旱胁迫后,干旱响应基因的表达变化,本研究以拟南芥响应干旱胁迫的标记基因AT3G56850(AREB3),AT2G36270(ABI5)和AT5G52300(RD29A/B)序列为模板,对银白杨的基因组(Vision1.0,NCBI数据库BioProject 序列号:PRJNA491245)进行了blastN搜索[12],共鉴定到了PaAREB3(scaffold1203: 615611-617752),PaABI5(scaffold264: 305707-307586),PaRD29(scaffold459: 248079-250269)三条基因。
将在温室中培养5周的银白杨植株进行干旱处理,分别在处理的0、2、4、6、8、10、12 d随机选4棵植株采集其第8片叶和根。使用RNAprep Pure Plant Kit(天根,北京)对采集样品进行总RNA的提取。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)(TakaRa)将总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板,通过RT-qPCR检测PaAREB3、PaABI5、PaRD29的表达量,RT-qPCR引物见表1。相对定量实验分别进行至少三次生物学重复和三次技术重复。
表 1 RT-qPCR检测银白杨干旱响应基因表达量的引物
Table 1. Primers used for the detection of drought-response genes by RT-qPCR
目的基因
Target gene引物名称
Primer name引物序列5’-3’
Primer sequence 5’-3’PaAREB3 PaAREB3-F GCAAACATGATGGGGAGATG PaAREB3-R ACAACAGGACCGCCATC PaABI5 PaABI5-F CTCGTCTCTTGGCAGACAAT PaABI5-R CAGTCCAGATACTGGCAAG PaRD29 PaRD29-F GGATGAAGAAATGGTTGAGG PaRD29-R ATCAGTGCCTGTATGTTCC PaActin PaActin-F GACCTTCAATGTGCCTGCAA PaActin-R CGAAGGATGGCATGTGGAAG
银白杨对干旱胁迫的生理响应研究
The Physiological Response of Populus alba to Drought Stress
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摘要:
目的 以银白杨为研究对象,探究干旱胁迫对其生长发育的影响,为解析多年生林木响应干旱胁迫的分子机制奠定基础。 方法 对生长在土里5周左右的银白杨幼苗进行干旱胁迫处理,通过观察其生长状态,测定与干旱胁迫相关生理指标以及检测相关基因表达情况,探究银白杨对干旱胁迫的耐受能力。 结果 对银白杨植株进行干旱处理8 d后,其叶片含水量明显下降、气孔开度变小;ROS含量明显上升,体内ABA积累、而与生长相关的IAA含量下降;与干旱胁迫相关的基因表达上调。 结论 通过多角度探究银白杨对干旱胁迫的耐受性,银白杨幼苗在干旱处理8 d后其生长受到显著抑制,建议及时浇水。 Abstract:Objective In this study, Populus alba was used to detect the effect of drought stress on growth and development, which provided reference for the molecular mechanism of the response to drought stress in woody. Method The seedlings of Populus alba about five weeks were treated with drought stress, the growth state and drought stress-related physiological indicators and genes were record and detected to reveal the resistance of Populus alba to drought stress. Result The results showed that the water content of leaves decreased significantly and stomatal aperture became smaller after 8 days of drought treatment; meanwhile ROS increased significantly, ABA accumulated in the body, and the growth-related hormone IAA content decreased, drought stress-related genes were upregulated. Conclusion By detecting the tolerance of Populus alba to drought stress from multiple perspective, the growth of their seedlings is significantly inhibited after drought treatment for 8 days, which indicates that watering timely is necessary. -
Key words:
- drought stress
- / Populus alba
- / physiological indicators
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表 1 RT-qPCR检测银白杨干旱响应基因表达量的引物
Table 1. Primers used for the detection of drought-response genes by RT-qPCR
目的基因
Target gene引物名称
Primer name引物序列5’-3’
Primer sequence 5’-3’PaAREB3 PaAREB3-F GCAAACATGATGGGGAGATG PaAREB3-R ACAACAGGACCGCCATC PaABI5 PaABI5-F CTCGTCTCTTGGCAGACAAT PaABI5-R CAGTCCAGATACTGGCAAG PaRD29 PaRD29-F GGATGAAGAAATGGTTGAGG PaRD29-R ATCAGTGCCTGTATGTTCC PaActin PaActin-F GACCTTCAATGTGCCTGCAA PaActin-R CGAAGGATGGCATGTGGAAG -
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