Cloning and Yeast Expression Function Identification of High Expression XsKCS7 Gene in Xanthoceras sorbifolium Seed

文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）特色抗旱栽培良种‘中石4号’（国S-SV-XS-015-2020）五年以上稳产实生苗生长于辽宁省阜新市彰武县（42°37′ N, 122°53′ E），种植区域年平均降水量为504 mm，年平均温度为7 °C，最低温度为−36 °C，最高温度为38 °C（数据来源于全国天气网），林间正常管理。用于本研究基因克隆所需的文冠果发育中期种子样品采集于2022年6月，种子样品经纯净水冲洗后擦干，液氮速冻后保存于−80 °C待用。用于酵母表达实验的生物酵母采用酿酒酵母菌株INVSc1。

下载Wang等公开的文冠果种子不同发育时期种子（开花后第40、54、68、81 d）转录组原始数据（SRA编号：PRJNA493982），以本研究室文冠果基因组数据为参考基因组进行联合分析^[16]，基因的表达水平根据FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments）进行计算。

文冠果发育中期种子样品RNA的提取方法参照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根，中国）说明书，经过降解酶RQ1 RNase-Free Dnase（Promega，美国）降解残留的基因组DNA后，以1 μg RNA为模板，利用GoScriptTM Reverse Transcription System（Promega，美国）试剂盒反转录得到cDNA。

依据文冠果基因组XsKCS7基因参考序列，设计上游（5′-CTCTTCTTGTTTAGCTACCCTTT -3′）和下游（5′- ATCCTTTTTATTCCATTCTCTTT -3′）特异性引物；以采集的文冠果发育中期种子cDNA为模板，利用kod高保真扩增酶（Toyobo，日本）扩增，经测序验证无突变的XsKCS7连接至克隆载体pGEM®-T Easy 载体系统构建（Promega，美国）并转化至大肠杆菌DH5α；再次测序验证序列后，将阳性菌液保存于−80 °C。

多重序列比对通过软件DNAMAN 7.0中的clustal X程序进行；系统性进化树分析由软件MEGA5.0中的neighbor-joining程序进行。

限制性内切酶HindⅢ 酶切酵母表达载体pYES2.0，设计带有同源臂的上游引物（5′-taagcttggtaccgagctcgATGGCTAATGAGAACAAAAA -3′）和下游引物序列（5′-gcggccgttactagtggatcTTAAATAACAATCGATGCAA -3′）扩增XsKCS7，以同源重组法构建酵母表达载体pYES2.0-Pro_GAL1::XsKCS7，操作方法参照试剂盒SeamLess Assembly Cloning Kit（中美泰合，中国）；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVSc1（Invitrogen, USA）菌株的转化采用聚乙二醇/醋酸锂（PEG/LiAc）诱导法^[17]。

转基因酵母在SD-U液体培养基中震荡至吸光值A₆₀₀至0.4～0.5后，加入总溶液1/10体积的20%半乳糖水溶液（m/v）激活酵母载体启动子GAL1表达XsKCS7，同时分别加入底物0.5 mmol·L⁻¹花生烯酸C20∶1芥酸C22∶1以及不加底物（酵母提取物自身含有油酸C18∶1），20 °C培养4 d；培养物于3 500 g离心10 min，收集酵母菌体，以真空冷冻干燥机在−40 °C环境下干燥12 h成粉末状，−80 °C保存用于脂肪酸含量和组分测定。

酵母提取物脂肪酸提取采用硫酸甲醇酯化法^[18]，提取的脂肪酸甲酯由乙酸乙酯溶解。吸取1.0 μL乙酸乙酯用于GC检测，检测仪器使用气相色谱仪，柱子使用强极性气相色谱柱DB-23。GC检测设置条件为：170 ℃，5 min；2 ℃·min⁻¹ 到210 ℃；柱箱210 ℃；压力163.8 kpa；总流量48.3 mL·min⁻¹；柱流量4.2 mL·min⁻¹；分流比10.0。

SapBase数据库（http://www.sapindaceae.com/）公开了由本研究室测序获得的文冠果基因组数据，共注释KCS基因20个^[14,16]，根据这些基因在染色体的位置分布，编号为XsKCS1～XsKCS20（图1）。基于参考基因组和转录组测序数据，分析得到文冠果KCS基因家族在高油文冠果种子不同发育时期的表达模式。结果如图2所示，XsKCS5、XsKCS6、XsKCS19及XsKCS20在文冠果种子各个发育时期的表达量均为0，不参与基因表达热图绘制；XsKCS7基因在种子中的表达量远高于其他KCS基因，表明XsKCS7基因可能调控文冠果种子油超长链脂肪酸的合成功能。

Figure 1.  The position of KCS genes in the chromosome of Xanthoceras sorbifolium

Figure 2.  Expression of XsKCS genes in seeds of Xanthoceras sorbifolium at different developmental stages

将采集的文冠果发育中期种子用液氮研磨后，使用RNA提取试剂盒抽提种子RNA，经电泳检测发现RNA具有清晰的28S和18S条带（图3A），同时Agilent 2100 Bioanalyzer分析仪检测RIN（RNA integrity number）值大于7.0，表明RNA完整性较好；分光光度计测量其OD₂₆₀ /OD₂₈₀值在1.95～2.05之间，表明RNA纯度高。

Figure 3.  Electrophoresis of RNA(A) and electrophoresis of the amplification of XsKCS7 gene(B)

以种子cDNA为模板，依据文冠果基因组XsKCS7基因参考序列设计的特异性引物扩增，连接至克隆载体后使用通用引物T7/SP6扩增并测序，最终获得包括XsKCS7基因CDS区的1 512 bp序列，扩增产物长度包括克隆载体骨架共1 681 bp（图3B）。

通过软件DNAMAN5.0将文冠果XsKCS7蛋白、梣叶槭（Acer negundo L.）AnKCS（NCBI注册号：KAI9194759.1；下同）、橡胶[Hevea brasiliensis (Willd. ex A. Juss.) Müll. Arg.]HbKCS11（XP_021653194.1）、石榴（Punica granatum L.）PgKCS11（XP_031382877.1）、木薯（Manihot esculenta Crantz）MeKCS20（XP_021595702.1）和白时钟花（Turnera subulata Smith）TsKCS11（KAJ4840348.1）蛋白进行多重序列比对。结果如图4所示，文冠果XsKCS7蛋白与其他植物KCS基因具有相似的保守基序（红框标出）。

Figure 4.  Multiple sequence alignment of KCS protein

采用软件MEGA5.0 neighbor-joining程序将XsKCS7蛋白与其他物种KCS蛋白进行系统性分析，参与构建系统进化树的物种包括：蓖麻（Ricinus communis L.）RcKCS6（XP_002510886.3）、大豆[Glycine max (L.) Merr.]GmKCS5（XP_003555356.2）、甘蓝型油菜（Brassica napus L.）BnKCS6（LOC106410639）、花生（Arachis hypogaea Linn.）AhKCS5（XP_025620215.1）、苦楝（Melia azedarach L.）MaKCS（KAJ4706144.1）、簸箕柳（Salix suchowensis W. C. Cheng in S. Y. Jin）SsKCS（KAG5230593.1）、山核桃[Carya illinoinensis (Wangenh.) K. Koch]CiKCS5（XM_043119331.1）、蒜头果（Malania oleifera Chun & S. K. Lee）MoKCS（MK210592.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtKCS10（NP_180193.1）、桃[Prunus persica (L.) Batsch]PpKCS5（XP_020411733.1）、梣叶槭AnKCS（KAI9162263.1）、漾濞槭（Acer yangbiense Y. S. Chen & Q. E. Yang）AyKCS（TXG70798.1）、蔷薇（Rosa chinensis Jacq.）RsKCS6（XP_024164718.1）、巴西橡胶树HbKCS11（XM_021797502.1）、阿月浑子（Pistacia vera L.）PvKCS20（XM_031416789.1）。结果如图5所示，XsKCS7蛋白与其他物种KCS蛋白亲缘性关系较近，其中与橡胶树亲缘关系最近，为67.62%。

Figure 5.  Phylogenetic tree analysis of KCS protein

将重组质粒pYES2.0-Pro_GAL1::XsKCS7（简写为pYES2.0-XsKCS7）和对照空载体pYES2.0转化酿酒酵母菌株INVSc1。酿酒酵母本身不具有超长链延长酶活性，pYES2.0对照组中未检测到花生烯酸（C20∶1）、芥酸（C22∶1）以及神经酸（C24∶1）。与pYES2.0对照组相比，pYES2.0-XsKCS7转基因酵母提取物未检测到其他脂肪酸（图6A1、B1）；与pYES2.0 + C20∶1对照组相比，pYES2.0-XsKCS7转基因酵母提取物中检测到了芥酸和微量的神经酸（图6A2、B2）；与pYES2.0 + C22∶1对照组相比，pYES2.0-XsKCS7转基因酵母提取物中检测到神经酸（图6A3、B3）。上述结果表明XsKCS7基因具有催化花生烯酸生成芥酸和催化芥酸生成神经酸的功能，但不具备油酸生成花生烯酸的功能。

Figure 6.  GC-MS analysis for FA components in yeast cells

文冠果是一种罕见的种子中富含神经酸的经济油料树种，而神经酸具有潜在的药用保健效用^[5]，是近年来国内外研究的热点。3-酮酯酰-CoA合酶基因（KCS）是调控超长链脂肪酸合成的限速酶基因，已在蒜头果^[19]、银扇草（Lunaria annua L.）^[20]、碎米荠（Cardamine graeca L.）^[21]等物种中克隆并鉴定其具有调控神经酸合成的功能，然而在文冠果中尚未解析。

本研究以文冠果基因组为参考基因组，重新分析文冠果种子不同发育时期转录组测序数据，发现XsKCS7基因在种子的表达量明显高于其他KCS基因。通过PCR法扩增得到XsKCS7基因序列，编码503个氨基酸；生物信息学分析发现，XsKCS7蛋白序列与其他物种KCS蛋白序列均具有KCS家族保守基序“GMGCSA”、“FGNTSSSS”以及“GSGFKCNSAVW”^[22]；系统进化树分析结果表明XsKCS7与其他物种KCS蛋白亲缘性关系较近，与橡胶树最近（图5）。以上结果表明克隆的XsKCS7基因具有潜在的3-酮酯酰-CoA合酶功能，然而其具体的功能还需进一步研究。

真核酿酒酵母表达是适合研究具有单一催化功能蛋白的异源表达系统，该系统已被许多研究用于鉴定KCS酶的功能。例如，在酿酒酵母菌株INVSc1中异源表达毛果杨（Populus trichocarpa L.）PtKCS1和PtKCS2，发现PtKCS1底物偏好为单不饱和脂肪酸，而PtKCS2偏好为多不饱和脂肪酸^[23]；银扇草和碎米荠KCS也通过酵母表达系统鉴定其具有以花生烯酸（C20∶1）为底物，生成神经酸的功能^[20-21]。本研究同样使用酿酒酵母菌株INVSc1表达系统，分别以油酸（C18∶1）、花生烯酸、芥酸（C22∶1）为底物异源表达文冠果XsKCS7基因，发现XsKCS7基因具有调控花生烯酸生成芥酸和催化芥酸生成神经酸的功能。以上结果表明不同物种KCS基因具有明显的底物特异性调控功能，而至今为止已被功能鉴定的KCS基因较少，应用生物信息学预测其功能的准确性较差，由此可见，单一KCS基因的功能研究极为必要。本研究通过酵母异源表达系统鉴定XsKCS7基因具有调控芥酸和神经酸的合成的功能，同时前期研究表明XsKCS7基因在文冠果种子发育期高表达，由此可见，XsKCS7基因是调控文冠果种子油超长链脂肪酸芥酸和神经酸合成的关键基因，为解析文冠果神经酸合成通路提供了扎实基础。

依据KCS基因在文冠果基因组染色体中的位置分布将20个KCS基因编号为XsKCS1～XsKCS20。以本研究室测序得到的文冠果基因组为参考基因组，重新分析文冠果种子不同发育时期转录组数据（SRA编号：PRJNA493982），发现XsKCS7基因在种子中的表达量远高于其他KCS基因。本研究克隆了文冠果XsKCS7基因，生物信息学分析其具有潜在的3-酮酯酰-CoA合酶功能，在酿酒酵母异源表达XsKCS7基因鉴定其具有调控芥酸和神经酸的合成功能。综上所述，XsKCS7基因是调控文冠果种子芥酸和神经酸合成的关键基因。